Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma
Summary
O hemizygosity recíproco através de arranjar em seqüência (RH-Seq) é um método novo poderoso para mapear a base genética de uma diferença do traço entre a espécie. As associações de hemizygotes são geradas pela mutagenese do transposon e sua aptidão é controlada com o crescimento competitivo usando o sequenciamento elevado-ao longo. A análise dos dados resultantes identifica genes subjacentes à característica.
Abstract
Um objetivo central da genética moderna é entender como e por que os organismos no selvagem diferem no fenótipo. Até agora, o campo avançou pela maior parte na força de métodos do enlace e da Associação de mapeamento, que traçam a relação entre variações da seqüência do ADN e phenotype através da progêia de recombinação dos acasalamentos entre indivíduos de uma espécie. Essas abordagens, embora poderosas, não são bem adaptadas às diferenças de traço entre espécies reproductivamente isoladas. Aqui nós descrevemos um método novo para a dissecção genoma-larga da variação natural do traço que pode prontamente ser aplicada às espécies incompatíveis. Nossa estratégia, RH-Seq, é uma implementação de todo o genoma do teste de hemizygote recíproco. Nós aproveitamos-lo para identificar os genes responsáveis para o crescimento de alta temperatura impressionante da levedura Saccharomyces cerevisiae em relação à sua espécie irmã S. paradoxus. RH-Seq utiliza a mutagenese do transposon para criar um pool de hemizygotes recíprocos, que são seguidos então através de uma competição de alta temperatura através de arranjar em seqüência da elevado-taxa de transferência. Nosso fluxo de trabalho RH-Seq, conforme estabelecido aqui, fornece uma maneira rigorosa e imparcial de dissecar traços antigos e complexos no clado de levedura em brotamento, com a advertência de que o sequenciamento profundo intensivo em recursos é necessário para garantir a cobertura genômica para o mapeamento genético. À medida que os custos de sequenciamento caem, essa abordagem tem grande promessa para uso futuro em eucariontes.
Introduction
Desde o alvorecer do campo, tem sido um objetivo primordial na genética para entender a base mecanicista da variação entre os indivíduos selvagens. À medida que mapeamos o locus subjacente a uma característica de interesse, os genes emergentes podem ser de uso imediato como alvos para diagnósticos e drogas, e podem esclarecer os princípios da evolução. O padrão da indústria para este fim é testar para uma relação entre o genótipo e o phenotype através de uma população através do enlace ou da Associação1. Poderosos como essas abordagens são, eles têm uma limitação-chave-eles dependem de grandes painéis de descendência recombinante de cruzamentos entre indivíduos cruzar. Eles não são de uso no estudo de espécies que não podem acasalar para formar progên em primeiro lugar. Como tal, o campo teve pouca capacidade para dissecção imparcial de diferenças de traço entre espécies reproductivamente isoladas2.
Neste trabalho, relatamos os fundamentos técnicos de um novo método, RH-Seq3, para levantamentos em escala de genoma da base genética da variação de traço entre espécies. Esta aproximação é uma versão maciçamente paralela do teste recíproco do hemizygote4,5, que foi concebida primeiramente como uma maneira de avaliar os efeitos fenotípicos de diferenças alélicas entre dois fundos genetically distintos em um locus específico (Figura 1a). Neste esquema, os dois indivíduos divergentes são primeiro acasalados para formar um híbrido, metade de cujo genoma vem de cada um dos respectivos pais. Neste contexto, múltiplas cepas são geradas, cada uma contendo uma cópia interrompida ou excluída do alelo de cada pai do locus. Estas tensões são hemizygous desde que permanecem Diploid em toda parte no genoma exceto no locus do interesse, onde são considerados Haploid, e são referidos como recíproco desde que cada um não falta somente o alelo de um pai, com seu alelo restante derivado do outros pais. Comparando os fenótipos destas tensões recíprocas do hemizygote, uma pode concluir se as variações da seqüência do ADN no locus manipulado contribuem ao traço do interesse, desde que as variações no locus são a única diferença genética entre o recíproco cepas de hemizygote. Dessa forma, é possível vincular diferenças genéticas entre as espécies a uma diferença fenotípica entre elas em uma configuração experimental bem controlada. Até o momento, as aplicações deste teste foram em um quadro de genes candidatos, ou seja, casos em que a hipótese já está em mãos que a variação natural em um locus candidato pode impactar uma característica.
No que se segue, nós dispor o protocolo para uma tela de hemizygosity reciprocidade em escala de genoma, usando levedura como um sistema modelo. Nosso método cria um complemento genómico de mutantes hemizygote, gerando híbridos F1 viáveis e estéreis entre as espécies e submetendo-os à mutagenese de Transposon. Nós pool os hemizygotes, medimos seus fenótipos em arranjar em seqüência-baseou ensaios, e testamos para diferenças na freqüência entre clones da associação que carregam os dois pais ‘ alelos de um gene dado. O resultado é um catálogo de loci em que variantes entre as espécies influenciam o traço de interesse. Implementamos o fluxo de trabalho RH-Seq para elucidar a base genética de diferenças de termotolerância entre duas espécies de levedura brotamento, Saccharomyces cerevisiae e S. paradoxus, que divergiram ~ 5 milhões anos atrás6.
Protocol
Representative Results
Discussion
As vantagens do RH-Seq sobre os métodos estatísticos-genéticos precedentes são várias vezes. Em contraste com a análise do enlace e da associação, RH-Seq oferece a definição do mapeamento do único-gene; como tal, provavelmente será de utilidade significativa mesmo em estudos de variação de traço entre indivíduos de uma determinada espécie, bem como diferenças interespecíficas. Também, as tentativas precedentes na análise recíproca genoma-larga do hemizygosity usaram coleções de mutants do apagamen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin e J. Skerker por suas contribuições para o estudo original, F. AlZaben, A. FLURY, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer, e L. Oltrogge para assistência técnica, D. Savage por sua generosidade com microscopia recursos, e B. Blackman, S. Coradetti, A. Flamholz, V. Guacci, D. Koshland, C. Nelson, e A. Sasikumar para discussões; Agradecemos também a J. Dueber (departamento de bioengenharia, UC Berkeley) pelo plasmídeo PiggyBac. Este trabalho foi apoiado pelo R01 GM120430-a1 e pelo projeto de sequenciamento da Comunidade 1460 para o RBB no Instituto do genoma conjunto do departamento de energia dos EUA, uma facilidade de usuário do escritório de ciência da DOE. O trabalho conduzido por este último foi apoiado pelo escritório da ciência do departamento de energia dos E.U. o contrato no. DE-AC02-05CH11231.
Materials
| 1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
| 10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
| 52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
| Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
| Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
| DMSO | Any | N/A | |
| E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
| Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
| LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Water bath at 39°C | Any | N/A | |
| Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
| Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
| YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
| YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |
Referências
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- Stern, D. L. Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test. Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).
- Steinmetz, L. M., et al. Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast. Nature. 416, 326-330 (2002).
- Scannell, D. R., et al. The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus. G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).
- Wetmore, K. M., et al. Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons. MBio. 6, e00306-e00315 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 550 (2014).
- Wilkening, S., et al. An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 196, 853-865 (2014).
- Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae. G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).
