게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑
Summary
시퀀싱 (RH-seq)을 통한 상호 반심은 종 간의 특성 차이의 유전적 기초를 매핑하는 강력한 새로운 방법입니다. hemizygotes의 풀은 트랜스포종 돌연변이 발생에 의해 생성되고 그들의 체력은 높은 전반에 걸쳐 시퀀싱을 사용하여 경쟁적인 성장을 통해 추적됩니다. 결과 데이터의 분석은 특성의 근본적인 유전자를 찾아낸다.
Abstract
현대 유전학의 핵심 목표는 야생의 유기체가 표현형이 다른 방법과 이유를 이해하는 것입니다. 현재까지, 필드는 종의 개별 사이 짝짓기에서 재조합 자손을 통해 DNA 서열 이체 및 표현형 사이 관계를 추적하는 연결및 협회 매핑 방법의 힘에 크게 진보했습니다. 이러한 접근법은 강력하지만 생식적으로 고립된 종 간의 특성 차이에 적합하지 않습니다. 여기에서 우리는 호환되지 않는 종에 쉽게 적용될 수 있는 자연적인 형질 변이의 게놈 전체 해부를 위한 새로운 방법을 기술합니다. 우리의 전략, RH-seq는, 상호 hemizygote 시험의 게놈 전체 구현입니다. 우리는 그것의 자매 종 S.역설에 상대적으로 효모 Saccharomyces cerevisiae의 눈에 띄는 고온 성장에 책임 있는 유전자를 확인하기 위하여 그것을 이용했습니다. RH-seq는 트랜스포손 돌연변이 발생을 이용하여 상호 반혈구 풀을 생성한 다음 고처리량 시퀀싱을 통해 고온 경쟁을 통해 추적합니다. 여기에 명시된 RH-seq 워크플로우에서는 신진 효모 클래드에서 고대의 복잡한 특성을 해부하는 엄격하고 편견없는 방법을 제공하며, 유전 매핑을 위한 게놈 커버리지를 보장하기 위해 자원 집약적인 깊은 시퀀싱이 필요하다는 경고와 함께 합니다. 시퀀싱 비용이 감소함에 따라 이 접근 방식은 진핵생물 전반에 걸친 향후 사용에 대한 큰 약속을 지니고 있습니다.
Introduction
필드의 새벽부터, 그것은 야생 개인에 걸쳐 변화의 기계론적 기초를 이해하는 유전학의 주요 목표되었습니다. 우리가 관심의 특성의 근본적인 loci를 지도로, 신흥 유전자는 진단과 약에 대한 표적으로 즉시 사용될 수 있고, 진화의 원리에 빛을 비출 수 있습니다. 이를 향한 업계 표준은 연결 또는 협회 1을 통해 인구에 걸쳐 유전자형과표현형 사이의 관계를 테스트하는 것입니다. 이러한 접근법은 강력한, 그들은 하나의 주요 제한-그들은 방해 개인 사이 십자가에서 재조합 자손의 큰 패널에 의존. 그(것)들은 처음에 자손을 형성하기 위하여 짝을 지을 수 없는 종의 연구 결과에서 아무 소용이 없습니다. 이와 같이, 필드는 생식 고립 된 종 사이의 특성 차이의 편견해부에 대한 작은 용량을 가지고있다 2.
이 작품에서 우리는 새로운 방법의 기술적 기초를보고, RH-seq3,종 사이의 형질 변이의 유전 적 기초의 게놈 규모 설문 조사. 이 접근법은 상호 반심고트 시험4,5의대규모 병렬 버전이며, 이는 처음에 두 개의 유전적으로 구별되는 두 가지 배경 사이의 유전적으로 구별되는 배경 사이의 유전적으로 구별되는 차이의 현상학적 효과를 평가하는 방법으로 생각되었다. 특정 궤적(그림1A). 이 계획에서, 2개의 발산한 개별은 그 게놈의 각각에게서 오는 그들의 게놈의 반을 형성하기 위하여 첫째로 짝짓기됩니다. 이 백그라운드에서는 각 계개의 대절의 중단되거나 삭제된 복사본을 포함하는 여러 균주가 생성됩니다. 이 균주는 관심의 궤적에서 제외 한 게놈의 사방에 diploid 남아 있기 때문에 hemizygous, 어디 그들은 haploid 간주 됩니다., 그리고 상호 로 불린다 각 하나의 부모의 eele 부족 하기 때문에, 그것의 나머지 eele파생 다른 부모. 이러한 상호 hemizygote 균주의 표현형을 비교함으로써, 하나는 조작 된 궤적에서 DNA 서열 변이체가 관심의 특성에 기여하는지 여부를 결론을 내릴 수 있습니다, 궤적에서 변이체는 상호 사이의 유일한 유전 적 차이이기 때문에 헤미지고테 균주. 이런 식으로, 잘 통제된 실험 적인 설치에 있는 그들 사이 phenotypic 차이에 종 사이 유전 적 차이를 연결하는 것이 가능합니다. 이 시험의 응용은 후보 유전자 프레임 워크에 있었다 현재까지- 즉, 후보 궤적의 자연 변이가 특성에 영향을 미칠 수 있다는 가설이 이미 손에있는 경우.
다음에, 우리는 모델 시스템으로 효모를 사용하여 게놈 규모의 상호 hemizygosity 스크린을 위한 프로토콜을 배치합니다. 우리의 방법은 종 사이 실행 가능한, 멸균 F1 하이브리드를 생성하고 트랜스 포종 돌연변이 유발에 복종하여 hemizygote 돌연변이의 게놈 보완을 만듭니다. 우리는 hemizygotes를 풀링하고, 시퀀싱 기반 분석에서 표현형을 측정하고, 주어진 유전자의 두 부모의 대식가를 가진 풀의 클론 사이의 주파수 차이를 테스트합니다. 결과는 종 사이의 변이체가 관심의 특성에 영향을 미치는 loci의 카탈로그입니다. 우리는 두 개의 신진 효모 종, 사카로 미세세세와 S. 역설사이의 열내성 차이의 유전 적 기초를 해명하기 위해 RH-seq 워크플로우를 구현, 이는 ~ 5 백만 년 전6.
Protocol
Representative Results
Discussion
RH-seq의 장점은 이전의 통계적 유전적 방법에 비해 여러 배입니다. 연결 및 연결 분석과는 달리 RH-seq는 단일 유전자 매핑 해상도를 제공합니다. 이와 같이, 그것은 가능성이 주어진된 종의 개인에 걸쳐 특성 변화의 연구에서 중요 한 유틸리티의 될 것입니다., 뿐만 아니라 상호 특이적 차이. 또한, 게놈 전반에 대한 상호 hemizygosity 분석에서 이전의 시도는 유전자 결실 돌연변이체의 수집을 사용했으…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin 및 J. Skerker가 원래 연구에 기여한 것에 대해 감사드립니다, F. AlZaben, A. Flury, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer, 및 L. Oltrogge는 그의 관대함을 위해, D. Savage는 그의 관대함을 위해 B. 블랙맨, S. 코라데티, A. 플램홀츠, V. 구아치, 디 코스흘랜드, C. 넬슨, A. 사시쿠마르가 토론을 위해; 우리는 또한 PiggyBac 플라스미드에 대한 J. 듀버 (생명 공학학과, UC 버클리)에게 감사드립니다. 이 작품은 R01 GM120430-A1과 지역 사회 시퀀싱 프로젝트 1460에 의해 미국 에너지 공동 게놈 연구소의 RBB에 의해 지원되었다, 과학 사용자 시설의 DOE 사무실. 후자에 의해 수행 된 작업은 계약 번호에 따라 미국 에너지부의 과학 사무실에 의해 지원되었다. DE-AC02-05CH11231.
Materials
| 1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
| 10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
| 52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
| Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
| Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
| DMSO | Any | N/A | |
| E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
| Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
| LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Water bath at 39°C | Any | N/A | |
| Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
| Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
| YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
| YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |
Referências
- Flint, J., Mott, R. Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls. Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).
- Allen Orr, H. The genetics of species differences. Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).
- Weiss, C. V., et al. Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance. Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).
- Stern, D. L. Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test. Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).
- Steinmetz, L. M., et al. Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast. Nature. 416, 326-330 (2002).
- Scannell, D. R., et al. The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus. G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).
- Wetmore, K. M., et al. Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons. MBio. 6, e00306-e00315 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 550 (2014).
- Wilkening, S., et al. An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 196, 853-865 (2014).
- Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae. G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).
