Fin dagli albori del campo, è stato un obiettivo primario nella genetica comprendere la base meccanicistica della variazione tra gli individui selvatici. Mentre tracciamo i loci alla base di un tratto di interesse, i geni emergenti possono essere di uso immediato come obiettivi per la diagnostica e la droga, e possono far luce sui principi dell’evoluzione. Lo standard di settore a tal fine è quello di verificare la necessità di una relazione tra genotipo e fenotipo tra una popolazione tramite collegamento o associazione¹. Per quanto potenti siano questi approcci, hanno una limitazione fondamentale: si basano su grandi pannelli di progenie ricombinante provenienti da croci tra individui interfertili. Sono inutile nello studio di specie che non possono accoppiarsi per formare la progenie in primo luogo. Come tale, il campo ha avuto poca capacità di dissezione imparziale delle differenze di tratto tra le specie riproduttivamente isolate².

In questo lavoro riportiamo le basi tecniche di un nuovo metodo, RH-seq³, per indagini su scala genomica della base genetica della variazione dei tratti tra le specie. Questo approccio è una versione massicciamente parallela del test reciproco dell’emizigote^4,5, che è stato inizialmente concepito come un modo per valutare gli effetti fenotipici delle differenze alleliche tra due sfondi geneticamente distinti in un particolare locus (Figura 1A). In questo schema, i due individui divergenti vengono prima accoppiati per formare un ibrido, la metà del cui genoma proviene da ciascuno dei rispettivi genitori. In questo contesto, vengono generati più ceppi, ciascuno contenente una copia interrotta o eliminata dell’allele di ogni genitore del locus. Questi ceppi sono emiziosi in quanto rimangono diploidi ovunque nel genoma tranne che nel luogo di interesse, dove sono considerati aploidi, e sono indicati come reciproci poiché ognuno manca solo all’allele di un genitore, con il suo allele rimanente derivato dal altro genitore. Confrontando i fenotipi di questi ceppi emizigote reciproci, si può concludere se le varianti della sequenza del DNA al locus manipolato contribuiscono al tratto di interesse, poiché le varianti al locus sono l’unica differenza genetica tra il reciproco ceppi emizygote. In questo modo, è possibile collegare le differenze genetiche tra le specie a una differenza fenotipica tra di loro in una configurazione sperimentale ben controllata. Ad oggi le applicazioni di questo test sono state in un quadro candidato-gene, cioè i casi in cui l’ipotesi è già in corso che la variazione naturale in un locus candidato potrebbe avere un impatto su un tratto.

In quello che segue, stabiliamo il protocollo per uno schermo di emizigosità reciproca su scala genomica, usando il lievito come sistema modello. Il nostro metodo crea un complemento genomico di mutanti emizigote, generando ibridi F1 vitali e sterili tra le specie e sottoponendoli a mutagenesi tra trasposoni. Mettiamo insieme gli emizigoti, misuriamo i loro fenotipi nei saggi basati sul sequenziamento e verifichiamo le differenze di frequenza tra i cloni della piscina recanti gli alleli dei due genitori di un determinato gene. Il risultato è un catalogo di loci in cui le varianti tra le specie influenzano il tratto di interesse. Implementiamo il flusso di lavoro RH-seq per chiarire la base genetica delle differenze di termotolleranza tra due specie di lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae e S. paradoxus, che ha diversificato 5 milioni di anni fa⁶.