जीनोम-वाइड पारस्परिक हेमीजिगिसिटी विश्लेषण के माध्यम से Saccharomyces खमीर की प्रजातियों के बीच थर्मोफ्लोरी अंतर की आनुवंशिक मानचित्रण
Summary
अनुक्रमण के माध्यम से पारस्परिक hemizygosity (आरएच-सेक) प्रजातियों के बीच एक विशेषता अंतर के आनुवंशिक आधार को मैप करने के लिए एक शक्तिशाली नई विधि है। hemizygotes के पूल transposon mutagenesis द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं और उनकी फिटनेस उच्च भर अनुक्रमण का उपयोग कर प्रतिस्पर्धी विकास के माध्यम से ट्रैक किया जाता है। परिणामी डेटा का विश्लेषण विशेषता अंतर्निहित जीनों को इंगित करता है।
Abstract
आधुनिक आनुवंशिकी का एक केंद्रीय लक्ष्य यह समझना है कि कैसे और क्यों जंगली में जीव फीनोटाइप में भिन्न होते हैं। तारीख करने के लिए, क्षेत्र काफी हद तक लिंकेज और एसोसिएशन मानचित्रण तरीकों की ताकत पर उन्नत किया गया है, जो डीएनए अनुक्रम वेरिएंट और एक प्रजाति के व्यक्तियों के बीच संभोग से रिकॉमबिनेंट संतान भर में phenotype के बीच संबंध का पता लगाने. इन दृष्टिकोणों, हालांकि शक्तिशाली, अच्छी तरह से प्रजनन अलग प्रजातियों के बीच अंतर विशेषता के लिए अनुकूल नहीं हैं. यहाँ हम प्राकृतिक विशेषता भिन्नता है कि आसानी से असंगत प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है के जीनोम व्यापक विच्छेदन के लिए एक नई विधि का वर्णन. हमारी रणनीति, आरएच-सेक, पारस्परिक हेमीजेगोटे परीक्षण का जीनोम-व्यापी कार्यान्वयन है। हमने इसका उपयोग अपनी बहन प्रजाति एस विरोधाभासके सापेक्ष खमीर सैकरोमाइसीस सेरेविएस के हड़ताली उच्च तापमान वृद्धि के लिए जिम्मेदार जीनों की पहचान करने के लिए किया . आरएच-सेक पारस्परिक हेमीजोजोट्स का एक पूल बनाने के लिए ट्रांसपोसन म्यूटजेनेसिस का उपयोग करता है, जिसे उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के माध्यम से उच्च तापमान प्रतियोगिता के माध्यम से ट्रैक किया जाता है। हमारे आरएच-सेक कार्यप्रवाह के रूप में यहाँ बाहर रखी नवोदित खमीर clade में प्राचीन, जटिल लक्षण विच्छेदन के लिए एक कठोर, निष्पक्ष तरीका प्रदान करता है, चेतावनी के साथ कि संसाधन गहन गहरी अनुक्रमण आनुवंशिक मानचित्रण के लिए जीनोमिक कवरेज सुनिश्चित करने की जरूरत है. अनुक्रमण लागत ड्रॉप के रूप में, इस दृष्टिकोण यूकैरियोट में भविष्य के उपयोग के लिए महान वादा रखती है।
Introduction
क्षेत्र की सुबह के बाद से, यह आनुवंशिकी में एक प्रमुख लक्ष्य जंगली व्यक्तियों में भिन्नता के मशीनी आधार को समझने के लिए किया गया है. जैसा कि हम ब्याज की एक विशेषता अंतर्निहित लोसी नक्शा, आकस्मिक जीन निदान और दवाओं के लिए लक्ष्य के रूप में तत्काल उपयोग की जा सकती है, और विकास के सिद्धांतों पर प्रकाश डाला जा सकता है. इस छोर की ओर उद्योग मानक लिंकेज या एसोसिएशन1के माध्यम से जनसंख्या भर में जीनोटाइप और फीनोटाइप के बीच संबंध के लिए परीक्षण करने के लिए है . इन दृष्टिकोणों के रूप में शक्तिशाली हैं, वे एक महत्वपूर्ण सीमा है-वे intereriner व्यक्तियों के बीच पार से पुनः संयोजक संतान के बड़े पैनलों पर भरोसा करते हैं. वे प्रजातियों है कि पहली जगह में संतान बनाने के लिए दोस्त नहीं कर सकते हैं के अध्ययन में कोई फायदा नहीं कर रहे हैं. इस प्रकार, इस क्षेत्र में प्रजनन पृथक प्रजातियों2के बीच विशेष अंतर के निष्पक्ष विच्छेदन के लिए बहुत कम क्षमता है।
इस कार्य में हम प्रजातियों के बीच विशेषता भिन्नता के आनुवंशिक आधार के जीनोम पैमाने पर सर्वेक्षण के लिए एक नई विधि, आरएच-सेक3की तकनीकी underpinnings रिपोर्ट. यह दृष्टिकोण व्युत्क्रम हेमीजिगोटे परीक्षण 4,5का एक विशाल समानांतर संस्करण है , जिसे पहली बार एक में दो आनुवंशिक रूप से भिन्न पृष्ठभूमि के बीच एलिलिक अंतरों के फेनोलिक प्रभावों का मूल्यांकन करने के तरीके के रूप में कल्पना की गई थी। विशिष् ट लोकपथ (चित्र 1क) इस योजना में, दो अलग-अलग व्यक्तियों को पहले एक संकर बनाने के लिए तैयार किया जाता है, जिनमें से आधे का जीनोम प्रत्येक संबंधित माता-पिता से आता है। इस पृष्ठभूमि में, कई उपभेदों उत्पन्न कर रहे हैं, प्रत्येक एक बाधित या टिड्डी के प्रत्येक माता पिता के allele के नष्ट कर दिया प्रतिलिपि युक्त. इन उपभेदों hemizygous के बाद से वे ब्याज की लोकपथ पर छोड़कर जीनोम में हर जगह द्विगुणित रहते हैं, जहां वे अगुणित माना जाता है, और पारस्परिक के रूप में संदर्भित कर रहे हैं के बाद से प्रत्येक केवल एक ही माता पिता के एलीले की कमी है, इसके शेष allele से व्युत्पन्न के साथ अन्य माता पिता. इन पारस्परिक hemizygote उपभेदों के phenotypes की तुलना करके, एक हेरफेर टिड्डी पर डीएनए अनुक्रम वेरिएंट ब्याज की विशेषता के लिए योगदान है कि क्या निष्कर्ष निकाल सकते हैं, क्योंकि टिड्डी पर वेरिएंट पारस्परिक के बीच ही आनुवंशिक अंतर कर रहे हैं हेमीजोट उपभेदों. इस तरह, यह एक अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगात्मक सेटअप में उन दोनों के बीच एक phenotypic अंतर करने के लिए प्रजातियों के बीच आनुवंशिक अंतर जोड़ने के लिए संभव है. आज तक इस परीक्षा के आवेदन एक उम्मीदवार-जीन ढांचे में रहे हैं-अर्थात, ऐसे मामले जिनमें परिकल्पना पहले से ही हाथ में है कि उम्मीदवार टिड्डी में प्राकृतिक भिन्नता एक विशेषता को प्रभावित कर सकती है।
इसके बाद, हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में खमीर का उपयोग कर, एक जीनोम पैमाने पर पारस्परिक hemizygosity स्क्रीन के लिए प्रोटोकॉल बाहर रखना. हमारी विधि प्रजातियों के बीच व्यवहार्य, बाँझ F1 संकर पैदा करने और उन्हें transposon mutagenesis के अधीन द्वारा, hemizygote उत्परिवर्ती के एक जीनोमिक पूरक बनाता है. हम hemizygotes पूल, अनुक्रमण आधारित परख में उनके phenotypes उपाय, और एक दिया जीन के दो माता पिता के alleles असर पूल के क्लोन के बीच आवृत्ति में अंतर के लिए परीक्षण. परिणाम loci की एक सूची है जिस पर प्रजातियों के बीच वेरिएंट ब्याज की विशेषता को प्रभावित करते हैं. हम आरएच-सेक कार्यप्रवाह को लागू करने के लिए दो नवोदित खमीर प्रजातियों के बीच थर्मोफ्लोरेंसी मतभेदों के आनुवंशिक आधार को स्पष्ट करने के लिए, Saccharomyces सेरेविसियाई और एसविरोधाभास, जो 5 लाख साल पहले diverged6.
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले सांख्यिकीय-आनुवंशिक तरीकों पर आरएच-सेक के फायदे कई गुना हैं। लिंकेज और एसोसिएशन विश्लेषण के विपरीत, आरएच-सेक एकल-जीन मानचित्रण संकल्प देता है; जैसे, यह संभावना भी एक दिया प्रजातियों के व्यक्तियो…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जे रूप, आर हैकली, मैं Grigoriev, ए Arkin और जे Skerker मूल अध्ययन के लिए उनके योगदान के लिए धन्यवाद, एफ अल ज़ैबेन, ए फ्लूरी, जी Geiselman, जे हांगकांग, जे किम, एम Maurer, और एल Oltrogge तकनीकी सहायता के लिए अपनी उदारता के लिए, डी. संसाधन, और बी ब्लैकमैन, एस Coradetti, ए Flamholz, वी Guacci, डी Koshland, सी नेल्सन, और ए Sasikumar चर्चा के लिए; हम भी पिग्गीबैक प्लाज्मिड के लिए जे डुबर (बायोइंजीनियरिंग विभाग, यूसी बर्कले) का धन्यवाद करते हैं। यह काम R01 GM120430-A1 द्वारा समर्थित किया गया था और संयुक्त जीनोम संस्थान, विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा के एक डीईओ कार्यालय में अमेरिकी ऊर्जा विभाग में RBB के लिए सामुदायिक अनुक्रमण परियोजना 1460 द्वारा. बाद के द्वारा किए गए कार्य अनुबंध नंबर के तहत अमेरिकी ऊर्जा विभाग के विज्ञान के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। डे-AC02-05CH11231.
Materials
| 1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
| 10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
| 52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
| Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
| Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
| DMSO | Any | N/A | |
| E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
| Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
| LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Water bath at 39°C | Any | N/A | |
| Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
| Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
| YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
| YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |
Referências
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- Allen Orr, H. The genetics of species differences. Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).
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- Stern, D. L. Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test. Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).
- Steinmetz, L. M., et al. Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast. Nature. 416, 326-330 (2002).
- Scannell, D. R., et al. The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus. G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).
- Wetmore, K. M., et al. Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons. MBio. 6, e00306-e00315 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 550 (2014).
- Wilkening, S., et al. An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 196, 853-865 (2014).
- Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae. G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).
