מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי
Summary
השפעה הדדית באמצעות רצף (RH-seq) היא שיטה חדשה ורבת עוצמה למפות את הבסיס הגנטי של הבדל תכונה בין מינים. בריכות המייזוליטיס נוצרות על ידי הטרנספורזיס והכושר שלהם מתבצע באמצעות הצמיחה התחרותית באמצעות רצף ברמה גבוהה. ניתוח הנתונים הנובעים מנקודות גנים שבבסיס התכונה.
Abstract
מטרה מרכזית של גנטיקה מודרנית היא להבין כיצד ומדוע אורגניזמים בטבע שונים ב פנוטיפים. עד היום, השדה התקדם בעיקר על כוחה של שיטות מיפוי הצמדה ושיוך, אשר מעקב אחר הקשר בין משתנים רצף ה-DNA ו לפנוטיפ באמצעות רקומביננטי צאצאים מתוך מצות בין אנשים של מין. גישות אלה, אם כי חזקות, אינן מתאימות באופן מתאים להבדלים בין מינים מבודדים מחדש. כאן אנו מתארים שיטה חדשה לניתוח הגנום-רחב של וריאציה תכונה טבעית שניתן להחיל בקלות על מינים לא תואמים. האסטרטגיה שלנו, RH-seq, היא יישום הגנום הרחב של מבחן ההופכי הופכי. אנו לרתום אותו כדי לזהות את הגנים האחראים על הצמיחה המרשימה בטמפרטורה גבוהה של שמרים סכביסים cerevisiae ס ביחס paradoxus המינים של אחותה . RH-seq מנצל טרנספסון מוטאנסיס כדי ליצור בריכה של הדדיות הדדית, אשר מסומנים לאחר מכן באמצעות תחרות בטמפרטורות גבוהות באמצעות רצף התפוקה הגבוהה. העבודה שלנו RH-seq כפי שהונחו כאן מספק קפדנית, דרך משוחדת כדי לנתח העתיקה, תכונות מורכבות ב שמרים לבשלה, עם האזהרה כי ברצף אינטנסיבי משאבים מרחוק נדרש כדי להבטיח כיסוי גנומית עבור מיפוי גנטי. כאשר העלויות ברצף ירידה, גישה זו מחזיקה הבטחה גדולה לשימוש עתידי על פני eukaryotes.
Introduction
מאז השחר של השדה, זה היה מטרה מעולה בגנטיקה כדי להבין את הבסיס המכונה של וריאציה על אנשים פראיים. כאשר אנו ממפים את הבית בבסיס תכונה של עניין, הגנים מתהווה יכול להיות שימוש מיידי כמטרות אבחון ותרופות, והוא יכול לשפוך אור על עקרונות האבולוציה. תקן התעשייה לקראת המטרה הזאת הוא לבחון את הקשר בין הגנוטיפ לבין הפנוטיפ באמצעות הצמדה או אסוציאציה1. רב עוצמה כמו גישות אלה, יש להם מגבלה אחת מפתח – הם סומכים על פאנלים גדולים של צאצאי רקומביננטי מן הצלבים בין אנשים הפרעות. הם אינם בשימוש בחקר המינים שאינם יכולים להזדווג ליצור צאצאים מלכתחילה. ככזה, לשדה יש יכולת מועטה לניתוח משוחד של הבדלים בין מינים מבודדים מחדש של2.
בעבודה זו אנו מדווחים על התחתון הטכני של שיטה חדשה, RH-seq3, עבור סקרים הגנום בקנה מידה של הבסיס הגנטי של וריאציה תכונה בין מינים. גישה זו היא גרסה מקבילה בנפט של הבחינה הדדית מבחן4,5, אשר היה לראשונה הגה כדרך להעריך את ההשפעות פנוטימית של הבדלים allelic בין שני רקעים שונים גנטית ב לוקוס מסוים (איור 1a). בערכה זו, שני האנשים מפוצלים הם הראשונים ליצור היברידית, מחצית הגנום אשר מגיע מכל אחד ההורים בהתאמה. ברקע זה, זנים מרובים מופקים, כל אחד המכיל עותק קטוע או נמחק של כל ההורה של כל הורה של לוקוס. זנים אלה הם hemizygous מאז הם נשארים דיפלואידי בכל מקום בגנום למעט במיקום של עניין, שם הם נחשבים haploid, והם מכונים הדדית מאז כל אחד חסר רק אלל של ההורה אחד, עם אלל הנותרים נגזר ה הורה אחר. על-ידי השוואת הפנוטיפים של זנים אלה he, הדדיים הדדית, אפשר להסיק אם משתנים רצף ה-DNA על מקום מניפולציות לתרום את התכונה של עניין, מאז המשתנים לוקוס הם ההבדל הגנטי היחיד בין הדדית זנים המיזוליציטים. בדרך זו, ניתן לקשר בין הבדלים גנטיים בין מינים לבין הבדל פנוטיוני ביניהם בכיוונון ניסיוני מבוקר. עד כה היישומים של בדיקה זו היו במסגרת מועמד-גן-כלומר, מקרים בהם ההשערה כבר בהישג יד כי וריאציה טבעית על לוקוס מועמד עשוי להשפיע על תכונה.
במה שלהלן, אנו מניחים את הפרוטוקול למסך הופכי בקנה מידה של הגנום, באמצעות שמרים כמערכת מודל. השיטה שלנו יוצרת השלמה גנומית של מוטציות heמיזרגוט, על ידי יצירת מוטאנטים של F1 כלאיים החיים בין המינים והוא מרכיב אותם לטרנספסון. אנחנו מאגר heמיזוליטיס, למדוד פנוטיפים שלהם לפי רצף מבוסס, ולבדוק הבדלים בתדר בין שיבוטים של הבריכה הנושאת שני ההורים ‘ אללים של גן נתון. התוצאה היא קטלוג של הבית שבו משתנים בין המינים משפיעים על תכונת הריבית. אנו מיישמים את זרימת העבודה RH-seq כדי להבהיר את הבסיס הגנטי של הבדלים התרמותרמיים בין שני מינים שמרים הנצה, סכביסים cerevisiae ס ו -S. paradoxus, אשר התפצל ~ 5,000,000 לפני שנה6.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרונות של RH-seq על פני שיטות סטטיסטיות-גנטיות קודמות הן מספר קיפול. בניגוד לניתוח ההצמדה וההתאגדות, הטיפול ב-RH-seq מעניק רזולוציית מיפוי של גנים בודדים; ככזה, סביר להניח שהיא תהיה בעלת תועלת משמעותית גם במחקרים של וריאציה של תכונה על פני אנשים ממין נתון, כמו גם הבדלים בין-ספציפיים. כמו כן, נסי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. אנחנו מודים לג רואופ, ר. האקלי, אני. גריגוריה, א. ארקין וג סקלקר על תרומתם למחקר המקורי, פ. אלזבאן, א. פלאם, ג. גגלמן, ג’יי הונג, י. קים, מ. מOltrogge, ו-ל. לסיוע טכני, ד. סאבאג ‘ לנדיבות עם מיקרוסקופ משאבים, ו-B. Blackman, ס. קוראדטי, א. פלמהולץ, נ’ גואצ’י, ד. כורטלנד, ס. נלסון ו-א. ססיקומאר לדיונים; כמו כן, אנו מודים לג דובר (המחלקה לביוהנדסה, אוניברסיטת ברקלי) עבור הפלאבאק. עבודה זו נתמכת על ידי R01 GM120430-A1 ועל ידי הקהילה רצף הפרויקט 1460 RBB בארה ב. המחלקה לאנרגיה משותפת מכון הגנום, משרד DOE של מתקן משתמש המדע. העבודה שנערכה על ידי האחרונה נתמכת על ידי משרד המדע של משרד האנרגיה של ארצות הברית תחת חוזה לא. דה-AC02-05CH11231.
Materials
| 1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
| 10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
| 52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
| Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
| Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
| DMSO | Any | N/A | |
| E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
| Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
| LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Water bath at 39°C | Any | N/A | |
| Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
| Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
| YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
| YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |
Referências
- Flint, J., Mott, R. Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls. Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).
- Allen Orr, H. The genetics of species differences. Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).
- Weiss, C. V., et al. Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance. Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).
- Stern, D. L. Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test. Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).
- Steinmetz, L. M., et al. Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast. Nature. 416, 326-330 (2002).
- Scannell, D. R., et al. The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus. G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).
- Wetmore, K. M., et al. Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons. MBio. 6, e00306-e00315 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 550 (2014).
- Wilkening, S., et al. An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 196, 853-865 (2014).
- Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae. G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).
