Seit beginne des Feldes, ist es ein hauptziel in der Genetik, die mechanistische Grundlage der Variation zwischen wilden Individuen zu verstehen. Wenn wir Loci, die einem Merkmal von Interesse zugrunde liegen, kartieren, können die entstehenden Gene als Ziele für Diagnostika und Medikamente sofort von Nutzen sein und Licht auf die Prinzipien der Evolution werfen. Der Industriestandard zu diesem Zweck besteht darin, eine Beziehung zwischen Genotyp und Phänotyp in einer Population über Verbindung oder Assoziation zu testen¹. So mächtig diese Ansätze auch sind, sie haben eine wichtige Einschränkung – sie verlassen sich auf große Platten rekombinanter Nachkommen aus Kreuzungen zwischen interfertilen Individuen. Sie nützen nichts bei der Untersuchung von Arten, die sich überhaupt nicht zur Nachkommenschaft paaren können. Als solches hatte das Feld wenig Kapazität für unvoreingenommene Zerlegung von Merkmalsunterschieden zwischen reproduktiv isolierten Arten².

In dieser Arbeit berichten wir über die technischen Grundlagen einer neuen Methode, RH-seq³, für genombasierte Erhebungen der genetischen Grundlagen der Merkmalsvariation zwischen den Arten. Dieser Ansatz ist eine massiv parallele Version des gegenseitigen Hemizygotentests^4,5, der zuerst als eine Möglichkeit konzipiert wurde, die phänotypischen Auswirkungen von allelischen Unterschieden zwischen zwei genetisch unterschiedlichen Hintergründen an einem besonderer Ort (Abbildung 1A). In diesem Schema werden die beiden divergierenden Individuen zunächst zu einem Hybriden verpaart, dessen Genom zur Hälfte von jedem der jeweiligen Elternteile stammt. In diesem Hintergrund werden mehrere Stämme generiert, die jeweils eine unterbrochene oder gelöschte Kopie des Alleels des Ortes enthalten. Diese Stämme sind hemizygot, da sie überall im Genom diploid bleiben, außer am Ort des Interesses, wo sie als haploid gelten, und werden als reziprok bezeichnet, da jeder nur ein Elternallel fehlt, wobei sein verbleibendes Allel von der anderen Elternteilen. Durch den Vergleich der Phänotypen dieser reziprok-hemizygoten Stämme kann man feststellen, ob DNA-Sequenzvarianten am manipulierten Ort zum Merkmal des Interesses beitragen, da Varianten am Ort der Klagegang der einzige genetische Unterschied zwischen dem hemizygote Stämme. Auf diese Weise ist es möglich, genetische Unterschiede zwischen den Arten mit einem phänotypischen Unterschied zwischen ihnen in einem gut kontrollierten Versuchsaufbau zu verknüpfen. Bis heute wurden die Anwendungen dieses Tests in einem Kandidaten-Gen-Framework eingereicht, d. h. in Fällen, in denen die Hypothese bereits in der Hand ist, dass natürliche Variationen an einem Kandidatenort eine Eigenschaft beeinflussen könnten.

Im Folgenden legen wir das Protokoll für einen genomgroßen gegenseitigen Hemizygositätsbildschirm fest, bei dem Hefe als Modellsystem verwendet wird. Unsere Methode schafft eine genomische Ergänzung von Hemizygotenmutanten, indem sie lebensfähige, sterile F1-Hybriden zwischen Arten erzeugt und sie der Transposon-Mutagenese aussetzt. Wir bündeln die Hemizygoten, messen ihre Phänotypen in Sequenzierungs-basierten Assays und testen auf Frequenzunterschiede zwischen Klonen des Pools, die die Allele der beiden Eltern eines bestimmten Gens tragen. Das Ergebnis ist ein Katalog von Loci, bei dem Varianten zwischen Denspezies das Merkmal des Interesses beeinflussen. Wir implementieren den RH-seq-Workflow, um die genetische neratorischen Grundlage für die Thermoverträglichkeitsunterschiede zwischen zwei angehenden Hefearten, Saccharomyces cerevisiae und S. paradoxus, aufzuklären, die vor 5 Millionen Jahren auseinandergingen.