رسم الخرائط الوراثية للاختلافات التسامح الحراري بين أنواع الخميرة Saccharomyces عن طريق تحليل الهيميزيغوستي على نطاق الجينوم المتبادل
Summary
الهيميزيغوستي المتبادلة عن طريق التسلسل (RH-seq) هو طريقة جديدة قوية لرسم الأساس الوراثي للفرق سمة بين الأنواع. يتم إنشاء برك من hemizygotes عن طريق الطفرات transposon ويتم تتبع لياقتهم من خلال النمو التنافسي باستخدام تسلسل عالية في جميع أنحاء. تحليل البيانات الناتجة يحدد الجينات الكامنة وراء السمة.
Abstract
الهدف الرئيسي لعلم الوراثة الحديثة هو فهم كيف ولماذا تختلف الكائنات الحية في البرية في النمط الظاهري. وحتى الآن، تقدم الحقل إلى حد كبير على أساس قوة أساليب رسم خرائط الروابط والروابط، التي تتبع العلاقة بين متغيرات تسلسل الحمض النووي والنمط الظاهري عبر الذرية المؤتلفة من التزاوج بين أفراد من نوع ما. وهذه النهج، وإن كانت قوية، ليست ملائمة تماما للاختلافات بين الأنواع المعزولة من الناحية الإنجابية. هنا نقوم بوصف طريقة جديدة للتشريح على نطاق الجينوم من الاختلاف الصفات الطبيعية التي يمكن تطبيقها بسهولة على الأنواع غير المتوافقة. استراتيجيتنا، RH-seq، هو تنفيذ على نطاق الجينوم لاختبار hemizygote المتبادلة. نحن تسخيرها لتحديد الجينات المسؤولة عن ارتفاع في درجة الحرارة ضرب نمو الخميرة Saccharomyces سيريفيسياي نسبة إلى الأنواع الشقيقة S. paradoxus. يستخدم RH-seq الطفرات المتحولة لإنشاء مجموعة من hemizygotes المتبادلة، والتي يتم تعقبها بعد ذلك من خلال المنافسة في درجات الحرارة العالية عن طريق تسلسل الإنتاجية العالية. يوفر سير عمل RH-seq لدينا كما هو منصوص عليه هنا طريقة صارمة وغير متحيزة لتشريح الصفات القديمة والمعقدة في الخميرة الناشئة، مع التحذير من أن التسلسل العميق كثيفة الموارد ضروري لضمان التغطية الجينية لرسم الخرائط الجينية. ومع انخفاض تكاليف التسلسل، فإن هذا النهج يبشر بالخير الكبير للاستخدام في المستقبل عبر eukaryotes.
Introduction
منذ فجر الحقل، كان من الأهداف الرئيسية في علم الوراثة فهم الأساس الآلي للتباين عبر الأفراد البرية. وبينما نرسم خريطة للمواقع الكامنة وراء سمة من سمات الاهتمام، يمكن أن تكون الجينات الناشئة ذات فائدة فورية كأهداف للتشخيص والمخدرات، ويمكن أن تلقي الضوء على مبادئ التطور. معيار الصناعة نحو هذه الغاية هو اختبار العلاقة بين النمط الجيني والنمط الظاهري عبر السكان عن طريق الربط أو الارتباط1. وعلى الرغم من قوة هذه المناهج، فإن لها قيدًا رئيسيًا واحدًا – فهي تعتمد على لوحات كبيرة من الذرية المؤتلفة من الصلبان بين الأفراد المتداخلين. فهي لا فائدة لها في دراسة الأنواع التي لا يمكن أن تتزاوج لتشكيل ذرية في المقام الأول. وعلى هذا النحو، لم يكن لدى الحقل سوى قدرة ضئيلة على تشريح غير متحيز للاختلافات بين الأنواع المعزولة من الناحية الإنجابية2.
في هذا العمل نبلغ عن الأسس التقنية لطريقة جديدة، RH-seq3،للدراسات الاستقصائية على نطاق الجينوم من الأساس الوراثي للاختلاف سمة بين الأنواع. هذا النهج هو نسخة موازية على نطاق واسع من اختبار hemizygote المتبادلة4،5، الذي تم تصوره لأول مرة كوسيلة لتقييم الآثار الفينوتية للاختلافات الاليلية بين اثنين من الخلفيات المتميزة وراثيا في مكان معين(الشكل 1A). في هذا المخطط، يتم تزاوج الفردين المتباينة أولا لتشكيل هجين، نصف الجينوم الذي يأتي من كل من الآباء والأمهات. في هذه الخلفية، يتم إنشاء سلالات متعددة، تحتوي كل منها على نسخة تمت مقاطعتها أو حذفها من أليل كل أحد الوالدين من موضع المركز. هذه السلالات هي hemizygous لأنها لا تزال ثنائية في كل مكان في الجينوم إلا في موضع الاهتمام، حيث أنها تعتبر haploid، ويشار إليها على أنها متبادلة منذ كل يفتقر إلى أليل أحد الوالدين فقط، مع الأليل المتبقية المستمدة من والد آخر. ب يقارن ال [فينوموالأنواع] من هذا تبادليّة [هميزجوت] سلالات, واحدة يستطيع استنتاج تّماإذا [دنا] تسلسل [فرينت] في ال يتلاعب مكان يسهم إلى الصفة الفائدة, بما أنّ [فرينت] في الموقع يكون الفرق وحيد وراثيّة بين التبادليّة سلالات hemizygote. وبهذه الطريقة، من الممكن ربط الاختلافات الجينية بين الأنواع بالفرق الفينوتي بينها في إعداد تجريبي جيد التحكم فيه. وحتى الآن كانت تطبيقات هذا الاختبار في إطار المرشح – الجينات – أي الحالات التي تكون فيها الفرضية بالفعل في متناول اليد أن الاختلاف الطبيعي في موقع مرشح قد يؤثر على سمة.
في ما يلي، وضعنا البروتوكول لشاشة hemizygosity على نطاق الجينوم المتبادلة، وذلك باستخدام الخميرة كنظام نموذجي. لدينا طريقة يخلق تكملة الجينوم من المسوخ hemizygote، من خلال توليد قابلة للحياة، الهجينة F1 العقيمة بين الأنواع وإخضاعها لتحول المتحولين. نحن نجمع الهيميزيغوت، ونقيس الأنماط الظاهرية في الاختبارات المستندة إلى التسلسل، ونختبر الاختلافات في التردد بين استنساخ المسبح الذي يحمل أليلات الوالدين لجين معين. والنتيجة هي كتالوج من loci التي المتغيرات بين الأنواع تؤثر على سمة الفائدة. نقوم بتنفيذ سير عمل RH-seq لتوضيح الأساس الوراثي للاختلافات التسامح الحراري بين نوعين من الخميرة الناشئة، Saccharomyces cerevisiae و S. paradoxus، والتي تباينت ~ 5 مليون سنة مضت6.
Protocol
Representative Results
Discussion
مزايا RH-seq على الأساليب الإحصائية الوراثية السابقة هي عدة أضعاف. وعلى النقيض من تحليل الروابط والروابط، فإن RH-seq يتيح دقة رسم خرائط الجينات الواحدة؛ على هذا النحو، فإنه من المرجح أن تكون ذات فائدة كبيرة حتى في دراسات الاختلاف سمة عبر الأفراد من نوع معين، فضلا عن الاختلافات بين محددة. أيضا، ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ج. روب، ر. هاكلي، إ. غريغورييف، أ. أركين و ج. سكركر على إسهاماتهم في الدراسة الأصلية، ف. الزابن، أ. فلوري، ج. جيسلمان، ج. هونغ، ج. كيم، م. ماورير، ول. أولتروج على المساعدة التقنية، د. سافاج على كرمه بالفحص المجهري بلاكمان، س. كارادتي، أ. فلامهولز، ف. غواتشي، د. كوشلااند، س. نيلسون، وأ. ساسيكومار لإجراء مناقشات؛ كما نشكر ج. دوبر (قسم الهندسة الحيوية، جامعة كاليفورنيا بيركلي) على بلازميد PiggyBac. وقد تم دعم هذا العمل من قبل R01 GM120430-A1 ومن قبل مشروع التسلسل المجتمعي 1460 إلى RBB في معهد الجينوم المشترك التابع لوزارة الطاقة الأميركية، وهو مكتب تابع لمكتب المستخدمين العلميين التابع لوزارة الطاقة. وحظي العمل الذي اضطلع به هذا الأخير بدعم من مكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة الأمريكية بموجب العقد رقم DE-AC02-05CH11231.
Materials
| 1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
| 10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
| 52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
| Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
| Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
| DMSO | Any | N/A | |
| E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
| Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
| LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Water bath at 39°C | Any | N/A | |
| Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
| Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
| YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
| YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |
Referências
- Flint, J., Mott, R. Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls. Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).
- Allen Orr, H. The genetics of species differences. Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).
- Weiss, C. V., et al. Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance. Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).
- Stern, D. L. Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test. Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).
- Steinmetz, L. M., et al. Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast. Nature. 416, 326-330 (2002).
- Scannell, D. R., et al. The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus. G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).
- Wetmore, K. M., et al. Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons. MBio. 6, e00306-e00315 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 550 (2014).
- Wilkening, S., et al. An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 196, 853-865 (2014).
- Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae. G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).
