Изоляция, Трансфекция и культура первичных человеческих моноцитов
Summary
Здесь представлен оптимизированный протокол для изоляции, культивирования, трансфектирования и дифференциации первичных моноцитов человека от ВИЧ-инфицированных лиц и здорового контроля.
Abstract
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) остается серьезной проблемой для здоровья, несмотря на внедрение комбинированной антиретровирусной терапии (САРТ) в середине 1990-х годов. В то время как антиретровирусная терапия эффективно снижает системную вирусную нагрузку и восстанавливает нормальные количество CD4и Т-клеток, она не восстанавливает полностью функциональную иммунную систему. Дисфункциональная иммунная система у ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих КРТ, может характеризоваться иммунной активацией, ранним старением иммунных клеток или постоянным воспалением. Эти условия, наряду с сопутствующими факторами, связанными с ВИЧ-инфекцией, усугубляют сложность болезни, которая не может быть легко воспроизведена в клеточных и животных моделях. Для исследования молекулярных событий, лежащих в основе иммунной дисфункции у этих пациентов, система культуры и манипулировать человеческими первичными моноцитами in vitro представлена здесь. В частности, протокол допускает культуру и трансфекцию первичных монцитов CD14и, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих ЦАРТ, а также вич-отрицательных мер контроля. Метод включает в себя изоляцию, культуру и трансфекцию моноцитов и моноцитов, полученных макрофагами. В то время как коммерчески доступные комплекты и реагенты используются, протокол обеспечивает важные советы и оптимизированные условия для успешного присоединения и трансфекции моноцитов с миРНК мимикрирующими и ингибиторами, а также с siRNAs.
Introduction
Инфекция вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) вызывает тяжелую иммунную дисфункцию, которая может привести к оппортунистическим инфекциям и приобретенному синдрому иммунодефицита (СПИД). Хотя ВИЧ-инфицированных пациентов, проходящих CART характеризуются низкими вирусными нагрузками и нормальной CD4И Т-клеток рассчитывает, функционирование иммунной системы может быть поставлена под угрозу в этих людей, что приводит к дисфункциональной иммунной реакции, которая была связана с повышенным риском развития рака1. Механизмы иммунной дисфункции у ВИЧ-инфицированных пациентов на КАРТ остаются в значительной степени неизвестными. Поэтому характеристика иммунных клеток, полученных пациентом, и изучение их биологии и функции является важнейшим компонентом текущих исследований в области ВИЧ.
Моноциты и макрофаги являются ключевыми регуляторами иммунных реакций и играют основополагающую роль в ВИЧ-инфекции2,3,4,5. Неоднородные и пластиковые в природе, макрофаги могут быть широко классифицированы в классическо активированных (M1) или альтернативно активированных (M2). Хотя эта общая классификация необходима при создании экспериментальных условий, статус поляризации макрофагов может быть обращен вспять различными цитокинов6,7,8,9. Хотя несколько исследований исследовали влияние ВИЧ-инфекции на моноциты и дендритные клетки, молекулярные детали моноцитных реакций в значительной степени неизвестны6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Среди факторов, участвующих в регуляции и функции иммунных клеток, микроРНК (миРНК), короткие некодировочные РНК, которые после транскрипционно регулируют экспрессию генов, были показаны, чтобы играть важную роль в контексте основных клеточных путей (т.е. рост, дифференциация, развитие, и апоптоз)20. Эти молекулы были описаны как важные регуляторы транскрипционных факторов, необходимых для диктовки функциональной поляризации макрофагов21. Исследована потенциальная роль миРНК в моноцитах ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих ЦАРТ, но прогресс в этой области требует гораздо больше работы22,23,24,25,26. В настоящем документе обсуждается оптимизированный метод перевода миРНК и сирны в первичные моноциты человека от ВИЧ-инфицированных пациентов и контроля.
Этот протокол опирается на коммерчески доступные реагенты и комплекты, так как непрерывность технической процедуры помогает устранить ненужные экспериментальные переменные при работе с клиническими образцами. Тем не менее, метод предоставляет важные советы (т.е. количество клеток, покрытых или краткое инкубации с сыворотки свободной среды для содействия присоединению клеток к пластине). Кроме того, условия поляризации, используемые в этом протоколе, вытекают из опубликованной работы27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол демонстрирует использование первичных клеток ВИЧ-инфицированных испытуемых в качестве модели для изучения моноцитов и макрофагов. ВИЧ-и пациенты, проходящие ЛЕЧЕНИЕ, живут с инфекцией в течение нескольких лет, а также могут иметь другие сопутствующие ин…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить ВИЧ клинической / опухолевой биопозитория core для предоставления пациентов образцов и клеточной иммунологии Метаболизм ядро для обеспечения потока цитометрии анализа. Этот проект был профинансирован NIH P20GM12288 и P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
Referências
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Pesquisa do Câncer. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
