Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten
Summary
Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.
Abstract
Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) blijft een belangrijke gezondheidszorg ondanks de introductie van gecombineerde antiretrovirale therapie (cART) in het midden van de jaren 1990. Hoewel antiretrovirale therapie de systemische virale belasting efficiënt verlaagt en het normale aantal CD4+ T-cellen herstelt, vormt het geen volledig functioneel immuunsysteem. Een disfunctioneel immuunsysteem in HIV-geïnfecteerde personen die kar ondergaan kan worden gekenmerkt door immuun activering, vroege veroudering van immune cellen, of aanhoudende ontsteking. Deze voorwaarden, samen met comorbide factoren die gepaard gaan met HIV-infectie, voegen complexiteit toe aan de ziekte, die niet gemakkelijk kan worden gereproduceerd in cellulaire en dierlijke modellen. Om te onderzoeken van de moleculaire gebeurtenissen onderliggende immuundisfunctie bij deze patiënten, een systeem voor cultuur en manipuleren van menselijke primaire monocyten in vitro wordt hier gepresenteerd. Specifiek, het protocol maakt het mogelijk voor de cultuur en transfectie van primaire CD14+ monocyten verkregen van HIV-geïnfecteerde personen die kar en HIV-negatieve controles ondergaan. De methode omvat isolatie, cultuur en transfectie van monocyten en monoyte-afgeleide macrofagen. Terwijl in de handel verkrijgbare kits en reagentia worden gebruikt, biedt het protocol belangrijke tips en geoptimaliseerde voorwaarden voor een geslaagde hechting en transfectie van monocyten met Mirna bootst en remmers, evenals met sirna’s.
Introduction
Humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1) infectie veroorzaakt ernstige immuundisfunctie, wat kan leiden tot opportunistische infecties en verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS). Hoewel HIV-geïnfecteerde patiënten die cART ondergaan worden gekenmerkt door lage virale belastingen en normale CD4+ T-celtellingen, kan de werking van het immuunsysteem in deze individuen worden aangetast, wat leidt tot een disfunctionele immuunrespons die is gekoppeld aan een verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker1. De mechanismen van immuun disfunctie bij HIV-patiënten in de winkelwagen blijven grotendeels onbekend. Daarom is het karakteriseren van patiënt afkomstige immuuncellen en het onderzoeken van hun biologie en functie een essentieel onderdeel van het huidige HIV-onderzoek.
Monocyten en macrofagen zijn belangrijke regulatoren van immuunresponsen en spelen fundamentele rollen bij HIV-infectie2,3,4,5. Heterogene en kunststof in de natuur, macrofagen kunnen breed worden geclassificeerd in klassiek geactiveerde (M1) of als alternatief geactiveerd (m2). Hoewel deze algemene indeling nodig is bij het instellen van experimentele omstandigheden, kan de polarisatie status van macrofagen worden omgekeerd door een verscheidenheid van cytokines6,7,8,9. Hoewel verschillende studies de effecten van HIV-infectie op monocyten en dendritische cellen hebben onderzocht, zijn de moleculaire Details van monocyte-gemedieerde reacties grotendeels onbekend6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Onder de factoren die betrokken zijn bij de regulering en functie van immuun cellen, microRNAs (miRNAs), korte niet-Codeer Rna’s die na transcriptioneel de genexpressie reguleren, is aangetoond dat het een belangrijke rol speelt in de context van belangrijke cellulaire trajecten (d.w.z. groei, differentiatie, ontwikkeling en apoptosis)20. Deze moleculen zijn beschreven als belangrijke regulatoren van transcriptiefactoren die essentieel zijn voor het diceren van de functionele polarisatie van macrofagen21. De mogelijke rol van miRNAs in monocyten van HIV-geïnfecteerde personen die kar ondergaan is onderzocht, maar vooruitgang in het veld vereist veel meer werk22,23,24,25,26. Deze paper bespreekt een geoptimaliseerde methode om miRNAs en siRNAs te transfect in primaire humane monocyten van HIV-geïnfecteerde patiënten en controles.
Dit protocol is gebaseerd op in de handel verkrijgbare reagentia en kits, omdat de continuïteit in de technische procedure helpt bij het elimineren van onnodige experimentele variabelen bij het werken met klinische monsters. Niettemin, de methode biedt belangrijke tips (dat wil zeggen, het aantal cellen verguld of korte incubatie met serum vrije media om de hechting van cellen aan de plaat te bevorderen). Bovendien zijn de in dit Protocol gebruikte polarisatie omstandigheden afgeleid van het gepubliceerde werk27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol toont het gebruik van primaire cellen van HIV-geïnfecteerde onderwerpen als een model voor het bestuderen van monocyten en macrofagen. HIV+ patiënten ondergaan kar leven met infectie voor meerdere jaren en kunnen ook andere co-infecties gerelateerd een gecompromitteerd immuunsysteem. Om immunomodulatie te bestuderen in de aanwezigheid van een chronische HIV-infectie, werden cellen rechtstreeks van patiënten geoogst. Aangezien miRNAs belangrijke rollen speelt in celontwikkeling en…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de HIV klinische/tumor Biorepository kern bedanken voor het verstrekken van patiënt monsters en de cellulaire immunologie metabolisme kern voor het verstrekken van Flowcytometrie analyse. Dit project werd gefinancierd door NIH P20GM121288 en P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
Referências
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Pesquisa do Câncer. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
