Identificare le mutazioni con lo scioglimento ad alta risoluzione in una popolazione di riso TILLING
Summary
In questo articolo, presentiamo il protocollo descritto come ad alta risoluzione di fusione di analisi di fusione (HRM)-based Target Induced Local Lesions In ducedato In genomes (TILLING). Questo metodo utilizza cambiamenti di fluorescenza durante la fusione del DNA duplex ed è adatto per lo screening ad alto throughput di inserimento/eliminazione (Indel) e singola sostituzione di base (SBS).
Abstract
Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) è una strategia di genetica inversa per lo screening ad alto throughput delle mutazioni indotte. Tuttavia, il sistema TILLING ha meno applicabilità per il rilevamento di inserimento/eliminazione (Indel) e TILLING tradizionale richiede passaggi più complessi, come la digestione di nucleale CEL I e l’elettroforesi gel. Per migliorare la produttività e l’efficienza di selezione, e per rendere possibile lo screening di entrambi gli Indels e le singole sottostizioni di base (SBS), viene sviluppato un nuovo sistema DI fusione ad alta risoluzione (HRM) basato su . Qui, presentiamo un protocollo DETTAGLIATO HRM-TILLING e mostriamo la sua applicazione nello screening delle mutazioni. Questo metodo è in grado di analizzare le mutazioni degli amplificatori PCR misurando la denaturazione del DNA a doppio filamento ad alte temperature. L’analisi HRM viene eseguita direttamente dopo la PCR senza ulteriori elaborazioni. Inoltre, un metodo di estrazione del DNA semplice, sicuro e veloce (SSF) è integrato con HRM-TILLING per identificare sia Indels che SBS. La sua semplicità, robustezza e produttività elevata lo rendono potenzialmente utile per la scansione delle mutazioni nel riso e in altre colture.
Introduction
I mutanti sono importanti risorse genetiche per la ricerca di genomica funzionale delle piante e l’allevamento di nuove varietà. Un approccio genetico in avanti (cioè dalla selezione mutante alla clonazione genica o allo sviluppo di varietà) era il metodo principale e unico per l’uso di mutazioni indotte circa 20 anni fa. Lo sviluppo di un nuovo metodo di genetica inversa, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) di McCallum et al.1 ha aperto un nuovo paradigma e da allora è stato applicato in un gran numero di specie animali e vegetali2. TILLING è particolarmente utile per l’allevamento di tratti tecnicamente difficili o costosi da determinare (ad esempio, resistenza alle malattie, contenuto minerale).
TILLING è stato inizialmente sviluppato per le mutazioni dei punti di screening indotte da mutageni chimici (ad esempio, EMS1,3). Esso comprende i seguenti passaggi: la creazione di una popolazione/e TILLING; preparazione e raggruppamento del DNA di singole piante; amplificazione PCR del frammento di DNA bersaglio; eterodulessi formazione per denaturazione e annessione di amplificatori PCR e scissione da ceL I nucleasi; e l’identificazione degli individui mutanti e delle loro specifiche lesioni molecolari3,4. Tuttavia, questo metodo è ancora relativamente complesso, richiede tempo e bassa velocità effettiva. Per renderlo più efficiente e con una maggiore produttività, sono stati sviluppati molti metodi TILLING modificati, come la cancellazione DI TILLING (De-TILLING) (Tabella 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
L’analisi della curva HRM, che si basa sui cambiamenti di fluorescenza durante lo scioglimento del DNA duplex, è un metodo semplice, conveniente e ad alta produttività per lo screening delle mutazioni e la genotipizzazione13. HRM è già stato ampiamente utilizzato nella ricerca vegetale tra cui HRM basato SU TILLING (HRM-TILLING) per lo screening delle mutazioni SBS indotte dalla mutagenesi EMS14. Qui, abbiamo presentato protocolli HRM-TILLING dettagliati per lo screening delle mutazioni (sia Indel che SBS) indotti dai raggi gamma (z) nel riso.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING si è dimostrato un potente strumento genetico inverso per identificare le mutazioni indotte per l’analisi funzionale genica e l’allevamento delle colture. Per alcuni tratti non facilmente osservabili o determinati, TILLING con rilevamento di mutazioni ad alto contenuto di velocità PCR può essere un metodo utile per ottenere mutanti per diversi geni. Il metodo HRM-TILLING è stato utilizzato nelle popolazioni mutagenizzate Di pomodoro12,grano11 e vine<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2016YFD0102103) e dalla National Natural Science Foundation of China (N. 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
Referências
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