JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Biologia do Desenvolvimento

Genotyping og kvantifisering av In Situ Hybridisering Farging i Sebrafisk

Published: January 28, 2020
doi:
10.3791/59956
, ,
1MRC Molecular Haematology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital,University of Oxford, 2BHF Centre of Research Excellence, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences,University of Birmingham

Summary

Genredigeringsteknologier har gjort det mulig for forskere å generere sebrafiskmutanter for å undersøke genfunksjon med relativ letthet. Her gir vi en veiledning for å utføre parallell embryogenotyping og kvantifisering av in situ hybridiseringssignaler i sebrafisk. Denne objektive tilnærmingen gir større nøyaktighet i fenotypiske analyser basert på in situ hybridisering.

Abstract

In situ hybridisering (ISH) er en viktig teknikk som gjør det mulig for forskere å studere mRNA-distribusjon in situ og har vært en kritisk teknikk i utviklingsbiologi i flere tiår. Tradisjonelt var de fleste genuttrykksstudier avhengige av visuell evaluering av ISH-signalet, en metode som er utsatt for bias, spesielt i tilfeller der prøveidentiteter er kjent som en priori. Vi har tidligere rapportert om en metode for å omgå denne skjevheten og gi en mer nøyaktig kvantifisering av ISH-signaler. Her presenterer vi en enkel guide for å anvende denne metoden for å kvantifisere uttrykksnivåene av gener av interesse for ISH-fargede embryoer og korrelere det med sine tilsvarende genotyper. Metoden er spesielt nyttig for å kvantifisere romlig begrensede genuttrykkssignaler i prøver av blandede genotyper, og det gir et objektivt og nøyaktig alternativ til de tradisjonelle visuelle poengberegningsmetodene.

Introduction

Innføringen av genomredigeringsteknologier (ZFN, TALENs og mer nylig, CRISPR/Cas9) har ført til en massiv økning i antall laboratorier rundt om i verden som benytter seg av disse systemene for å studere funksjonen til spesifikke gener in vivo. Sebrafisk spesielt er mottagelig for genetisk manipulasjon og mange mutanter har blitt generert i den siste siste1,2. For utviklingsbiologer er en av de vanligste metodene for å vurdere de fenotypiske konsekvensene av genmutasjoner i embryonisk utvikling in situ hybridisering (ISH). I fravær av åpenbare morfologiske defekter som skiller homozygot mutanter fra deres ville type eller heterozygous søsken, er det viktig å kunne identifisere forskjellige genotyper nøyaktig.

Klassisk ISH er avhengig av kvalitative analyser av signalintensiteter for å utlede konklusjoner om regulatoriske interaksjoner mellom genet av interesse og utvalgte markørgener. Selv om det er nyttig, lider disse analysene av teknisk variasjon og kan være partisk av forskernes forventninger. Dermed ble det utviklet en metode for å kvantifisere genuttrykk etter avbildning av ISH-fargede embryoer, uten forutgående kjennskap til den tilsvarende genotypen. Dette ble etterfulgt av en effektiv DNA-ekstraksjon og genotyping som tillot oss å kvantitativt korrelere genotype med genuttrykk3. Mens genotyping av embryoer post ISH har blitt brukt før4,5, bildebasert kvantifisering av ISH mønstre har ikke vært mye brukt bortsett fra et par studier6,7. De mest populære alternativene er avhengige av visuell skåring eller telling av ISH-fargede celler8,9,10, både utsatt for dårlig reproduserbarhet og forskerbias. Denne metoden er spesielt nyttig for å studere endringer i gener med uttrykksmønstre som er romlig begrenset, for eksempel runx1 eller gata2b, begge uttrykt i en begrenset undergruppe av aortagulvceller kalt hemogen endothelium11,12.

Her tar vi sikte på å gi en praktisk guide til gjennomføringen av kvantifiseringen ved hjelp av Fiji13,samt DNA-ekstraksjon og genotyping-protokollen. Dette er ment å illustrere visuelt vår tidligere publiserte metode3. Vår metode gir en nøyaktig representasjon av variasjonen i genuttrykk oppdaget av ISH og en objektiv tildeling av genuttrykksnivåer til bestemte genotyper.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyrefag er regulert av Dyreloven (Scientific Procedures) 1986 og er godkjent av Hjemmekontoret og det lokale dyrevelferds- og etiske tilsynsorganet. 1. Bilde ISH-farget embryoer Forbered en glyserolløsning (50 %–80 % i 1x PBS-buffer) og bland for å homogenisere oppløsningen (f.eks. la det stå i en rulle i minst 5 min). Denne løsningen kan holdes i flere måneder ved romtemperatur. Etter in situ hybridisering14,15,16,17, overføre embryoer til glyserol løsning med en 3 ml Pasteur pipette og la det bosette seg i minst 5 min. Hvis bildeembryoer eldre enn 24 hkf (timer etter befruktning), kan de blekes som beskrevet18. Forbered og merk nok PCR-rør til å overføre ish-farget embryoer etter bildebehandling. Tilsett 100% glyserol til bunnen av brønnen i et glass depresjon lysbilde med en 3 ml pasteur pipette. Ved hjelp av en 3 ml Pasteur pipette, overfør et enkelt ISH-farget embryo til glasslysbildet og orienter etter behov under et stereomikroskop utstyrt med et digitalt kamera og bunn- og toppbelysning.MERK: Bruk gelelasterforter for å plassere embryoene for bildebehandling, men andre verktøy (f.eks. tang, dissekeringsnål) vil være like tilstrekkelige. Bruk det første embryoet til å justere belysnings- og eksponeringstiden ved ønsket forstørrelse. Bruk disse forholdene for ALLE embryoene i samme eksperiment (dvs. hvis bildebehandling 40 embryoer fra en heterozygous mutering incross, sørg for at belysningen, eksponeringstiden og forstørrelsen er den samme for alle). Bilde så mange embryoer som nødvendig. Merk hvert bilde med et unikt nummer. Etter bildebehandling overfører du embryoet til et PCR-rør/plate merket med samme nummer.MERK: Bilder skal lagres som TIF-filer, men andre formater er også tilstrekkelige. Fjern eventuelt overflødig glyserol i PCR-rørene/platene.MERK: På dette punktet kan embryoene lagres i PCR-rørene i flere uker ved romtemperatur. 2. Trekk ut DNA og genotype ish-farget embryoer MERK: Her, bruk en pålitelig og rimelig metode for å isolere genomisk DNA basert på HoTSHOT-metoden19 med en DNA-ekstraksjonseffektivitet på 95%-100%3. Etter at avbildningen er fullført, tilsett 40-75 μL alkalisk lysisbuffer (f.eks. HoTSHOT) til hvert rør. Inkuber ved 95 °C i ca. 30 min og avkjøl rørene til 4 °C før du legger til et likt volum nøytraliseringsbuffer. En inkubasjon over natten ved 4 °C kan forbedre PCR-effektiviteten.MERK: På dette punktet kan det genomiske DNA brukes til genotyping eller lagret ved -20 °C til det er nødvendig. Genotype prøver med en passende metode (f.eks HRMA, RFLP)3,20,21 som kreves for mutasjon av interesse. Vær oppmerksom på genotypen som tilsvarer hvert eksempel (f.eks. ved hjelp av en regnearkprogramvare). 3. Kvantifiser pikselintensiteten til ISH-farget embryoer (bildeanalyse ved hjelp av Fiji-programvare) For å kvantifisere in situ hybridisering (ISH) farging signalintensitet, konvertere alle bilder til 8-bit gråtoner som beskrevet3. Hvis bildene ble lagret som . TIF-filer, bruker du en Fiji-makro for satsvis konvertering3. Alternativt kan du konvertere bilder i andre formater (f.eks. . JPG) til . TIF ved hjelp av riktig programvare og deretter konvertere til 8-bit gråtoner ved hjelp av Fiji. For enkelhets skyld, her er den trinnvise prosedyren som ble publisert tidligere3, med noen endringer. Åpne bilder i Fiji og inverter bildet med Rediger > Inverter. Deretter endrer du bildetypen til 8-biters (Bilde > Tekst > 8-biters). Bruk av polygonemarkeringsverktøyet, tegn interesseområdet (ROI) manuelt på bildet rundt området som inneholder signalet. Trykk t for å åpne ROI-lederen. Bruk kommandoen mål for AVKASTNING-lederen til å måle intensiteten i avkastningen. Kopier gjennomsnittsverdien fra Resultat-vinduet til en regnearkprogramvare. Flytt den samme avkastningen, noe som sikrer samme størrelse og form som den opprinnelige regionen, til en region av sebrafisken som ikke inneholder noen farging. Gjenta trinn 3.4 for å måle bakgrunnen. For å oppnå den gjennomsnittlige pikselintensiteten til ISH-signalet, trekk middelintensitetsverdien i bakgrunnsområdet fra den beisede regionen for hvert embryo. Tilordne hver intensitetsverdi til en genotype (fra trinn 2.3). 4. Analyser resultatene med passende statistiske tester Plott alle verdiene på ett Q-Q-plott for å identifisere avvik fra normal fordeling.MERK: Normal distribusjon kan også verifiseres med Kolmogorov-Smirnov-testen eller Shapiro-Wilk-testen. Men for store utvalgsstørrelser er det stor risiko for falske positiver i disse testene. Hvis det er sterke avvik fra normal fordeling, forvandle alle verdiene (ved hjelp av ln eller sqrt funksjoner) for å sikre at de er normalt fordelt før du fortsetter. Analyser forskjellene mellom verdiene (forvandlet om nødvendig) tildelt hver genotype (wt vs. heterozygote vs. mutant) med 2-tailed ANOVA med 95% konfidensnivåer, og står for likestilling av varianser med en Levenes test og Welch korreksjon. For parvis sammenligninger mellom hvert par genotyper, bruk Tukeys (like avvik) eller Games-Howell (ulik avvik) post-hoc-test. Hvis verdiene vanligvis ikke distribueres til tross for transformasjonen, bruk en ikke-parametrisk test (Kruskall-Wallis) for å analysere forskjellene mellom rangerte verdier og en post-hoc Dunns flere sammenligninger test med Bonferroni korreksjon for parvis Sammenligninger. Plott de utransformerte verdiene (fra trinn 3.6) som punktplott for best mulig representasjon av resultatene.

Representative Results

Her beskriver vi den praktiske anvendelsen av rørledningen for bildemengde og embryogenotyping som publisert andre steder3. Arbeidsflyten for metoden vises i figur 1. For å illustrere hvordan du bruker denne metoden, ble ISH utført for dnmt3bb.1 i 33 hpf embryoer fra en runx1W84X/+22 incross ( Figur2). 130 embryoer ble avbildet ved hjelp av de samme belysningsforholdene som beskrevet i protokollen og merket dem med et unikt nummer. Etter bildebehandling ble hvert embryo overført til et PCR-rør for genotyping. På dette tidspunktet ble bildeanalysen utført for å tilskrive en pikselintensitetsverdi til hvert bilde. Genotypen ble deretter tildelt det tilsvarende bildet og pikselintensitetsverdiene gruppert i henhold til deres genotype for statistisk analyse. Det ble oppdaget en reduksjon i dnmt3bb.1-uttrykket i runx1W84X/W84X mutanter (figur 2A,B)3, i samsvar med tidligere observasjoner5. Interessant, runx1W84X / + heterozygous embryoer viste ingen signifikante forskjeller i dnmt3bb.1 uttrykk (Figur 2A,B) sammenlignet med sine villtype søsken, noe som tyder på at en kopi av Runx1 er tilstrekkelig til å opprettholde dnmt3bb.1 uttrykk på passende nivåer. Mange sebrafiskmutanter klarer ikke å vise en embryonisk fenotype som ellers kan oppdages ved hjelp av annet tap av funksjonsteknologier som morfinooligonucleotides (MOer). Denne uoverensstemmelsen kan tilskrives en rekke årsaker, inkludert off-target effekter, maternal protein kompensasjon, en hypomorfe allele23 eller nylig oppdaget fenomen av genetisk kompensasjon24,25,26,27. I dette eksemplet spurte vi om runx1-uttrykket ble redusert eller tapt i lmo4auob100 mutanter siden tidligere publiserte data ved hjelp av en lmo4a MO foreslo at runx1 er redusert i lmo4a morfanter28. Her viste analysen ingen signifikante forskjeller i runx1-uttrykk mellom villtype og lmo4auob100 homozygous mutanter3 (Figur 3A,B). Videre analyse av enkelt embryo qPCR viste at det var en liten, men signifikant reduksjon i runx1 uttrykk i lmo4auob100 mutanter (Figur 3C). Dermed er det mulig at bildekvantifisering kanskje ikke kan oppdage små forskjeller i uttrykksnivåer. Alternativt er mangelen på forskjell mellom genotyper som vi oppdaget ekte, og qPCR-eksperimentene oppdager endringer i runx1-uttrykk i andre vev som telenchephalon hvor både lmo4a og runx1 uttrykkes. Forskere bør alltid verifisere sine resultater med en uavhengig metode som qPCR, men ideelt berikende for vev av interesse ved flyt cytometri, for eksempel. I sjeldne tilfeller der ISH har høy bakgrunn (Figur 3D),er pikselintensitetsverdien for dette området så høy at subtraksjon fra signalverdien gir et negativt tall, og i slike tilfeller vil disse embryoene bli utelukket fra analysen. Etter vår erfaring skjedde dette i ca. 0,4 % av de runx1-probedeembryoene3, men kan variere mellom eksperimenter, sonder eller grupper av reagenser. Selv om det kan være en begrensning av metoden, er den lave frekvensen av høy bakgrunn svært usannsynlig å påvirke de samlede resultatene. For å teste effekten av å velge ulike områder for bakgrunnskorrigeringer, målte vi først pikselintensiteten til runx1 ISH-signalet i 28 hpf embryoer, ved hjelp av forskjellige regioner for bakgrunnskorrigeringer (Figur 4). Fire forskjellige regioner ble valgt: to i trunk-regionen (R1 og R2), en i eggeplommeregionen (ufarget, men sannsynlig å samle bakgrunnsfarging) og et mindre område ordemølle til avkastningen (R4, Figur 4B). Måling av pikselintensitet i disse områdene viste en relativt stabil intensitetsforskjell mellom avkastning og begge bakgrunnsområder (figur 4C). R3 viste imidlertid alltid svært høye verdier (over de i avkastningen). Etter inversjon og konvertering til 8-bit, eggeplomme regionen vises veldig lyse og dermed er ikke egnet for bruk som en bakgrunnskorreksjon. R2 var nærmere avkastningen, men inneholdt noe ISH-signal, og bruk av det til korreksjon reduserte gjennomsnittlig pikselintensitet sammenlignet med enten R1 (plassert ytterligere dorsally, vekk fra ISH-signalet) eller R4. Dermed er enten R1 eller R4 passende områder som kan brukes til bakgrunnskorreksjon (til tross for at R4-området er mindre enn r1). Deretter ønsket vi å sammenligne hvordan bruk av R1 eller R4 påvirket resultatene når vi sammenligner runx1-uttrykk. For dette, vi incrossed dll4+/- heterozygotes29 og analysert runx1 uttrykk i tilfeldig valgt vill type og dll4-/-embryoer (Figur 4E). Selv om bruk av R1 eller R4 for bakgrunnskorrigering påvirket individuelle verdier, var de gjennomsnittlige pikselintensitetene i samme genotype ikke signifikant forskjellige (figur 4E). Videre gir sammenligning av runx1-uttrykk fortsatt lignende gjennomsnittlige intensitetsverdier mellom genotyper ved hjelp av enten R1- eller R4-områder som bakgrunnskorrigering (μR1=16,3 og μR4=18,2). Samlet konkluderte vi med at selv om valget av bakgrunnsområde er viktig, er hovedkriteriene at det ikke inkluderer eggeplommeregioner (utsatt for akkumulering av bakgrunnsfarging) og at det ikke skal inneholde noen (spesifikk) farging som kan forvrenge pikselintensitetsverdiene i bakgrunnen. Figur 1: Arbeidsflyt for parallellbildeantall og genotyping-protokollen. Embryoer samlet fra en incross av fisk heterozygous for en mutert allele er undersøkt for det målte genet med en standard ISH-protokoll. Etter bildebehandling ekstraheres genomisk DNA ved hjelp av HotSHOT-protokollen ved å legge lysisbufferen direkte til embryoet i et 0,2 ml PCR-rør, etterfulgt av en 30 min inkubasjon ved 95 °C. Dette DNA-et brukes til genotyping av embryoene av PCR, PCR og begrensningfragmentlengde polymorfisme (RFLP), KASP-analyser eller annen passende metode. Parallelt er bildene for hvert embryo invertert og omdannes til 8-bits gråtoner. ROIer av identisk form og størrelse som inneholder ISH-signalet (gul) og bakgrunn (blå) velges manuelt og måles. Målingene, tildelt tilsvarende genotyper, analyseres statistisk. Figur tilpasset fra Dobrzycki et al.3Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Bildemengde i runx1 mutanter avslører reduserte nivåer av dnmt3bb.1 uttrykk av ISH. (A) Eksempel bilder av ISH i 33 hpf wild type (blå), runx1+/W84X (grønn) og runx1W84X/W84X (oransje) embryoer, som viser dnmt3bb.1 uttrykk i dorsal aorta. (B) Pikselintensitetsverdier for dnmt3bb.1 mRNA i runx1W84X/W84Xembryoer (n=36) reduseres betydelig sammenlignet med ville typer (n=32) og heterozygotes (n=62) (ANOVA, p < 0,001). Variasjonskoeffisientene er henholdsvis 24 %, 22 % og 21 % for villtype, heterozygote og mutantgrupper. Blått, grønt og oransje datapunkt tilsvarer eksempelbildene fra panel A. Barene representerer gjennomsnittlig ± s.d. ***p<0.001 (Games-Howell post-hoc test). Figur tilpasset fra Dobrzycki et al.3Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Måle runx1 uttrykksnivåer etter ISH i lmo4auob100mutanter. (A) Representative bilder av ISH for runx1 i 28 hpf vill type (blå), heterozygous (grønn) og lmo4auob100/uob100 (oransje) embryoer, som viser uttrykket i dorsal aorta. (B) Kvantifisering av runx1 mRNA-signalet, oppdaget av ISH, fra 28 hkf wild type (n = 15), heterozygous lmo4a+/- (het) (n = 34) og lmo4auob100/uob100 mutant (n = 18) embryoer fra en clutch viser ingen signifikant forskjell i runx1 pixel intensitet blant de forskjellige genotypene (ANOVA,> p 0,6). Blått, grønt og oransje datapunkt tilsvarer eksempelbildene fra panel A. Stolpene representerer gjennomsnittlig ± s.d. (C) Boxplots som viser normaliserte runx1 mRNA nivåer (2-ΔCt) i enkelt vill type (blå; n = 12) og lmo4auob100 / uob100 (mut, oransje; n = 12) embryoer, målt ved qRT-PCR, viser reduserte nivåer av runx1 i mutantene sammenlignet med vill type. *p < 0,05 (t test). (D) Eksempel på et ISH-eksperiment på et 28 hkf embryo (farget for runx1, gule pilspisser) som viser høy bakgrunn. Figur tilpasset fra Dobrzycki et al.3Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Effekten av korrigering av bakgrunnsintensitet på måleutfall. (A) Representativt bilde av runx1 ISH farging i en vill type embryo på 28 hkf. (B) Samme bilde etter inversjon og konvertering til 8-bit. Interesseområdet (AVKASTNING) er uthevet i grønne og fire forskjellige områder som brukes til bakgrunnskorrigering (R1-R4) er uthevet i gult. (C) Målinger av rå pikselintensitet i alle regioner som vises i panel B. Merk at intensiteten i R3 (eggeplomme) er konsekvent høyere enn det faktiske ISH-signalet i avkastningen (n=11). (D) Runx1 uttrykksnivåer i avkastningen ved hjelp av R1, R2 og R4 bakgrunnområder. Områder for AVKASTNING, R1, R2 og R3 ~ 28500 piksler; R4 ~ 8500 piksler. Legg merke til at R3-bakgrunn ikke ble brukt for denne sammenligningen som bakgrunnskorrigering (ROI-R3) ga konsekvent negative verdier. (E) Runx1 uttrykksnivåer i vill type og dll4-/- mutanter ved hjelp av enten R1 eller R4 for bakgrunnskorrigering (n = 10 for hvert eksempel). Statistisk analyse i panel d og E ble utført ved hjelp av en ikke-parametrisk Kruskal-Wallis-test, forutsatt at pikselintensitetsverdiene normalt ikke distribueres. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Discussion

Noen faktorer bør vurderes ved bruk av denne metoden for å kvantifisere genuttrykk. Bildebehandlingsforholdene må opprettholdes gjennom hele eksperimentet (for eksempel belysning, eksponeringstider og embryoposisjonering) for å redusere variasjonmellom målinger. Et kritisk punkt er å unngå overstaining av prøvene, da forskjeller i flekker mellom prøver kan maskeres. For eksempel kan nedgangen i VegfA-uttrykk i fravær av Eto2 i Xenopus laevis embryoer30 bare oppdages ved å nøye overvåke flekker over en 24-timers periode. Dermed er det god praksis å empirisk bestemme tilstrekkelige fargingnivåer for hvert gen som best representerer uttrykket, uten å nå metning. Overstaining vil også kunstig øke bakgrunnspikselintensiteten i de konverterte 8-biters gråtonebildene og forvrenge kvantitetsresultatene. I ekstreme tilfeller kan bakgrunnsnivået i embryonale vev være høyere enn ISH-signalet i den valgte avkastningen, og disse prøvene bør utelukkes fra analysen. Et lignende fenomen ble observert da vi testet egnetheten til den ufargede eggeplomme for bakgrunnskorreksjon (figur 4). Etter inversjon og konvertering til 8-bit mørkere piksler i eggeplomme regionen blir lysere enn ISH signalet i embryoet og gjengi bakgrunnen korrigert verdier negative. Dermed unngå bruk av eggeplomme for bakgrunnskorreksjon. Måling av bakgrunnssignalet i pigmenterte områder i embryoet (f.eks. øynene eller den dorsaldelen av stammen fra 26/28 hpf og utover) vil like forskyve kvantasjonsresultatene og bør også unngås. Det finnes protokoller tilgjengelig for bleking av sebrafiskembryoer, enten før eller etter ISH18 og bleking embryoer eldre enn 24 hkf før bildebehandling anbefales.

Fordi denne metoden er avhengig av å måle pikselintensiteten i et definert område mot en bakgrunnspikselintensitet i et tilsvarende ikke-farget område, er det ikke hensiktsmessig for kvantasjon av allestedsnærværende eller nesten allestedsnærværende uttrykte gener som den er. I stedet er det godt egnet for måling av uttrykk for gener med en romlig begrenset fordeling der et område for måling av bakgrunnspikselintensitet lett kan identifiseres. Vår tilleggsanalyse tyder nå på at bruk av et mindre område (3-4x mindre) for bakgrunnskorrigering gir lignende resultater til å bruke et tilsvarende område til avkastningen. Dette utvider anvendelsen av metoden til gener uttrykt i bredere romlige domener (og dermed krever større ROIer for intensitetsmålinger), så lenge man kan bruke klart ufargede områder av embryoet for bakgrunnskorreksjon.

Til slutt foreslår vi at genotyping utføres parallelt eller etter bildemengden for å minimere eksperimentererbias. Å be en annen eksperimenterer om å gjenta mengden på anonymiserte prøver og sammenligne med det første settet med målinger, vil også bidra til å redusere eksperimentererbias. Hvis bildene som skal kvantifiseres er fra en sammenligning mellom behandlinger som ikke krever genotyping (f.eks. vill type vs kjemisk hemmer eller vill type vs. MO knockdown), bør eksperimentereren som utfører målingene bli blindet til identiteten til Eksempel.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke de ansatte i Biomedical Services i Oxford og Birmingham for utmerket sebrafisk husdyrhold. T.D. ble finansiert av et Wellcome Trust Chromosome and Developmental Biology PhD Scholarship (#WT102345/Z/13/Z). R.M. og M.K. ble finansiert av British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) og er takknemlige for deres sjenerøse støtte. R.M. anerkjenner støtte fra BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.

Materials

0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) StarLab A1402-3700 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples
3 mL Pasteur pipettes Alpha Laboratories LW4114
Cavity slides Brand BR475535-50EA
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) Qimaging
Eppendorf Microloader tips Eppendorf 10289651 the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol
Excel Microsoft
F3000 Fiber Optic Cold Light Source Photonic
Fiji
Glycerol Sigma G5516-1L
Graphpad Prism 8.01 GraphPad Software, Inc. we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)
HotSHOT alkaline lysis buffer 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12
HotSHOT neutralization buffer Tris HCl 40 mM, pH 5
PBS (10X) pH 7.4 Thermofisher 70011044
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) Nikon
Thermocycler Thermofisher
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  2. Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
  3. Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
  4. Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
  5. Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
  6. Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
  7. Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
  8. Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
  9. Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Biologia do Desenvolvimento. 311 (2), 623-635 (2007).
  10. Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
  11. Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
  12. Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
  15. Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
  16. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  17. Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
  18. Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
  19. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  20. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  21. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  22. Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
  23. Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
  24. El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
  25. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  26. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  27. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  28. Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
  29. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  30. Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).

Tags

GenotypingIn Situ HybridizationQuantificationImage AnalysisZebrafishGene ExpressionDNA ExtractionAlkaline LysisROIImage ProcessingFiji

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Monteiro, R. Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish. J. Vis. Exp. (155), e59956, doi:10.3791/59956 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image