तंत्रिका स्टेम सेल और चूहे के दिमाग में 5-hydroxymethylcytosine का पता लगाने
Summary
यहाँ, हम कोशिकाओं और मस्तिष्क के ऊतकों में 5-हाइड्रॉक्सीमेथिलसाइटोसाइन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए डॉट ब्लॉट विधियों का उपयोग करते हैं।
Abstract
स्तनधारी जीनोम में कई डीएनए संशोधनों की पहचान की गई है। इनमें से 5-मेथिलसाइटोसाइन और 5-हाइड्रॉक्सीमेथिलसाइटोसाइन-मध्य-एपिजेनेटिक तंत्र का गहन अध्ययन किया गया है। 5-हाइड्रॉक्सीमेथिल साइटोसाइन मस्तिष्क के भ्रूण और प्रसवोत्तर विकास के दौरान गतिशील विशेषताओं को प्रदर्शित करता है, जीन अभिव्यक्ति में एक नियामक समारोह निभाता है, और कई न्यूरोलॉजिकल विकारों में शामिल है। यहाँ, हम सुसंस्कृत कोशिकाओं और माउस के मस्तिष्क के ऊतकों में 5-hydroxymethylcytosine का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए डॉट ब्लॉट सहित विस्तृत तरीकों का वर्णन करते हैं।
Introduction
डीएनए संशोधन, हिस्टोन संशोधन और आरएनए संशोधन सहित एपिजेनेटिक संशोधनों को विविध जैविक प्रक्रियाओं और रोगों में आवश्यक कार्य करने के लिए दिखाया गया है1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7.एक लंबे समय के लिए, डीएनए मिथाइलेशन (यानी, 5-मेथिलसाइटोसाइन (5-एमसी) को एक अत्यधिक स्थिर एपिजेनेटिक मार्कर के रूप में देखा गया है और इसे जीनोम में और संशोधित नहीं किया जा सकता है। हाल ही में, यह पाया गया है कि टीईटी 1, टीईटी 2 और टीईटी 38,9सहित टीईटी (दस-इलेवन ट्रांसलोकेशन) परिवार प्रोटीन द्वारा 5-हाइड्रॉक्सीमेथिल साइटोसाइन (5-एचएमएस) को 5-एमसी ऑक्सीकृत किया जा सकता है। आगे के अध्ययनों से पता चलता है कि 5-एचएमएस एक स्थिर मार्कर के रूप में काम कर सकता है और जीन अभिव्यक्ति4,10,11,12को विनियमित करने के माध्यम से जैविक भूमिका निभा सकता है .
वर्तमान साक्ष्यों से पता चलता है कि 5-एचएमएस स्तनधारियों में अन्य प्रकार के ऊतकों के सापेक्ष न्यूरोनल ऊतकों/कोशिकाओं में अत्यधिक समृद्ध है, और तंत्रिका विकास13,14के दौरान गतिशील विशेषताओं को दर्शाती है। न्यूरोनल सिस्टम में, 5-एचएमएस मध्यस्थता एपिजेनेटिक संशोधन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, न्यूरॉन गतिविधि, सीखने और स्मृति, और Rett सिंड्रोम सहित कई न्यूरोलॉजिकल विकारों में शामिल है, आत्मकेंद्रित, अल्जाइमर रोग , हंटिंगटन रोग आदि2,13,15,16,17,18,19,20.
कोशिकाओं और ऊतकों में 5-hmC का पता लगाने के लिए कई दृष्टिकोण हैं14,21,22,23,24. यहाँ, हम 5-एचएमएस के अस्तित्व का पता लगाने के लिए दो विधियों का वर्णन करते हैं और 5-एचएमएस के वैश्विक स्तर की मात्रा निर्धारित करते हैं: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए डॉट ब्लॉट। ये दो तरीके सुविधाजनक और संवेदनशील हैं और पिछले अध्ययनों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है25,26,27,28,29,30. इन दो तरीकों के प्रमुख कदम डीएनए विकृतीकरण हैं। 5-एचएमएससी के इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला के लिए, 1 एम एच सीएल के साथ नमूनों के पूर्व उपचार की आवश्यकता है। 5-hmC डॉट ब्लॉट के लिए, डीएनए विकृतीकरण NaOH समाधान के साथ किया जाता है। इन दो तरीकों के साथ अगली पीढ़ी अनुक्रमण 5-hmC के समारोह की जांच के लिए बहुत उपयोगी उपकरण हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenetic संशोधनों मस्तिष्क के विकास के दौरान आवश्यक भूमिका निभाते हैं, परिपक्वता, और समारोह. डीएनए संशोधन के लिए एक स्थिर मार्कर के रूप में, गतिशील 5-hmC व्यवहार अनुकूलन करने के लिए प्रतिक्रिया करता है, न्यूरॉ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एक्स्ट्रा लार्ज भाग में चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFE0196600) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 31771395, 31571518) द्वारा समर्थित किया गया था। Q.S. चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFC1001703) और झेजियांग प्रांत (2017C03009) के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। W.X. झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (LY18H020002) और झेजियांग प्रांत के विज्ञान प्रौद्योगिकी विभाग (2017C37057) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
| epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
| forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
| neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
| nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
| OCT | Leica | 14020108926 |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
| phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
| proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
| retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
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