Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Matthias Kn&#246;dler; Clemens R&#252;hl; Patrick Opdensteinen; Johannes  F. Buyel

doi:10.3791/59933

JoVE Journal > Biochemistry

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Bioquímica

Agarose reticulado activado para el desarrollo rápido de resinas de cromatografía de afinidad - Captura de anticuerpos como caso de estudio

Published: August 16, 2019

doi:

10.3791/59933

Matthias Knödler^1,3, Clemens Rühl², Patrick Opdensteinen^1,3, Johannes F. Buyel^1,3

¹Institute for Molecular Biotechnology,RWTH Aachen University, ²Sanofi Deutschland GmbH, ³Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME,Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

Summary

En este procedimiento, un ligando de epítopos a base de DsRed se inmoviliza para producir una resina de afinidad altamente selectiva para la captura de anticuerpos monoclonales a partir de extractos de plantas crudas o sobrenatantes de cultivo celular, como alternativa a la proteína A.

Abstract

La purificación de anticuerpos monoclonales (mAbs) se logra comúnmente mediante la cromatografía de afinidad de proteína A, que puede representar hasta el 25% de los costos totales del proceso. Por lo tanto, las etapas de captura alternativas y rentables son valiosas para la fabricación a escala industrial, donde se producen grandes cantidades de un solo mAb. Aquí presentamos un método para la inmovilización de un ligando de epítopos a base de DsRed a una resina de agarosa reticulada que permite la captura selectiva del anticuerpo neutralizante del VIH 2F5 a partir de extractos de plantas brutas sin utilizar la proteína A. El epítopo lineal ELDKWA se fusionó genéticamente con la proteína fluorescente DsRed y la proteína de fusión se expresó en plantas de tabaco transgénico (Nicotiana tabacum) antes de la purificación por cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizada. Además, se optimizó un método basado en agarosa reticulada activada para una alta densidad de ligando, acoplamiento eficiente y bajos costos. La composición de pH y tampón y la concentración de ligando soluble fueron los parámetros más importantes durante el procedimiento de acoplamiento, que se mejoró utilizando un enfoque de diseño de experimentos. La resina de afinidad resultante fue probada por su capacidad para unir selectivamente el mAb objetivo en un extracto de planta bruta y el búfer de elución fue optimizado para la alta recuperación de mAb, la actividad del producto y la estabilidad de la resina de afinidad. El método se puede adaptar fácilmente a otros anticuerpos con epítopos lineales. Las nuevas resinas permiten condiciones de elución más suaves que la proteína A y también podrían reducir los costos de un paso de captura inicial para la producción de mAb.

Introduction

Los productos biofarmacéuticos son importantes para el tratamiento de un amplio espectro de enfermedades en casi todas las ramas de la medicina¹. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) dominan el mercado biofarmacéutico, y se espera que las ventas mundiales alcancen casi 110.000 millones de euros en 2020². La plataforma de expresión favorecida para mAbs son las líneas celulares de ovario de hámster chino, que normalmente producen tetas de alto mAb de hasta 10 g-L^-1 en el sobrenadante de cultivo³^,⁴. Sin embargo, la producción de mAbs en cultivos celulares de mamíferos es costosa debido al alto costo del medio y la necesidad de fermentación estéril⁵. Las plataformas de expresión alternativa, como las plantas, ofrecen potencialmente un enfoque más rápido, sencillo, menos costoso y más escalable para la fabricación industrial⁶^,^7.

Además de los costos asociados con los cultivos celulares de mamíferos, el uso generalizado de la cromatografía de afinidad de proteína A para la captura de productos es un importante factor de costo para la producción industrial de mAbs. La proteína A se encuentra naturalmente en la superficie de las células de Staphylococcus aureus y se une a la región de fragmentoscristalizables (Fc) de ciertos anticuerpos murinos y humanos, actuando así como un mecanismo de defensa para evadir el sistema inmunológico humoral 8. La proteína A se ha convertido en el estándar de oro de la industria para la captura de mAbs de los supernatantes de cultivo celulary también es ampliamente utilizado por la comunidad de investigación porque es altamente selectivo, por lo general logrado las purezas de mAb de 95% en un solo paso 8. Como era de esperar, las ventas de proteína A en las últimas dos décadas han reflejado estrechamente las ventas de mAbs^8. Dependiendo de la escala de producción, los costes de la proteína A pueden corresponder a más del 25 % de los costes totales del proceso y, por lo que, en el precio de mercado de los mAbs terapéuticos, que pueden ser de hasta 2.000 g^-15,⁹. Por lo tanto, las resinas de cromatografía alternativas con un rendimiento de purificación similar tienen el potencial de reducir sustancialmente los costos de producción, haciendo que las terapias basadas en anticuerpos sean accesibles para un mayor número de pacientes^10,¹¹ ^,¹². Estas alternativas también pueden eludir las desventajas de la cromatografía de proteína A, incluidas las duras condiciones de elución a un pH bajo (normalmente <3.5) que pueden causar que los mAbs se sometan a cambios de conformación que promueven la agregación¹³ . Es importante destacar que la proteína A es selectiva sólo para la región Fc de ciertas subclases igG, por lo que las moléculas no funcionales con dominios de unión truncados pueden co-purificar se con el producto intacto^5,mientras que las derivaciones de mAb como los fragmentos variables de cadena única no se adhieran a la Proteína A en absoluto.

Aquí, describimos una resina de cromatografía de afinidad alternativa para la captura del mAb 2F5 neutralizador del VIH utilizando su epítopo lineal ELDKWA (código de aminoácido de una letra)⁵^,¹⁴. Hemos fusionado genéticamente el epítopo 2F5 con el término C de la proteína fluorescente DsRed, que funcionaba como una molécula portadora y reportera, y producimos la proteína resultante DsRed-2F5-E pitope (DFE) en tabaco transgénico ( Nicotiana tabacum) plantas. DFE fue purificado mediante cromatografía de afinidad de iones de metal inmovilizada de un solo paso (IMAC). La inmovilización del ligando de afinidad DFE purificado sobre una resina de agarosa reticulada se logró mediante el acoplamiento químico utilizando columnas de agarosa reticuladas activadas por N-hidroxisuccinimmida (NHS). A continuación, se utilizaron diseños experimentales estadísticos para optimizar el procedimiento de inmovilización y la eficiencia del acoplamiento^15. La estrategia de purificación de mAb 2F5 se evaluó en términos de pureza de anticuerpos, rendimiento y estabilidad de ligandos. A diferencia de la Proteína A, que une la región Fc, DFE se une a la región determinante de la complementariedad de 2F5, asegurando la purificación de moléculas con un paratopo intacto. Nuestro concepto se puede adaptar fácilmente a cualquier mAb con un epítopo lineal o a otros ligandos de afinidad basados en péptidos que pueden ser fácilmente identificados por los estudios de microarray^16.

Figura 1: Esquema de flujo de proceso para la preparación de resinas de afinidad de epítopos que se pueden utilizar para la captura de mAbs a partir de extractos de plantas brutas o sobrenatantes de cultivo celular. (A) El ligando de afinidad DFE se expresó en plantas de tabaco transgénicas. Se incluyó un paso de precipitación térmica (B) antes de que las hojas cosechadas se homogeneizaran (C). (D) El extracto de la planta bruta se aclaró mediante la filtración de bolsas, la filtración de profundidad y la filtración estéril de 0,2 m. (E) DFE fue purificado por IMAC. (F, G) El ligando de afinidad DFE purificado fue inmovilizado en columnas de agarosa reticulada activadas por EDC/NHS. (H) Los cultivos bacterianos que transportan el anticuerpo de codificación T-DNA 2F5 se utilizaron para la expresión transitoria en plantas de N. benthamiana (I) cultivadas en un fitotrón. (J) Las hojas de N. benthamiana fueron cosechadas y procesadas como se describe en D. (K) mAb 2F5 fue purificada a partir del extracto clarificado utilizando las columnas de afinidad DFE (L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Cultivar las plantas de tabaco transgénicas NOTA: El diseño de la proteína de fusión DFE yla generación de plantas transgénicas se describen en otros lugares 5,17. Germinar las plántulas de tabaco transgénicas en el suelo. Irrigar las plantas con un 1,0 g . Solución de fertilizanteL-1. Transfiera las plantas a macetas individuales de 100 mm x 100 mm x 60 mm (largo, ancho, alto) cuando crezcan hasta un diámetro de 0,04 m. Cultivar las plantas de tabaco transgénicas en un invernadero con un fotoperiodo de 16 h (régimen de temperatura clara/oscura de 25/22 oC), con un 70% de humedad relativa y fertilización automatizada con un 1,0 g L-1 solución de fertilizante durante 15 min cada hora. Después de 7 semanas, cosechar todas las hojas excepto las cuatro hojas de cotileba en la base del tallo de la planta. Procesar inmediatamente las hojas cosechadas como se describe a continuación. 2. Precipitación de calor de las proteínas de células anfitrionas Establecer un baño de agua con un volumen de trabajo de 20 L en un recipiente calentado de acero inoxidable (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). Al principio, coloque una bomba magnética en el baño de agua para agitar el líquido permanentemente con un flujo de 5 L min-1. Monte un termostato ajustable en el baño de agua para el control de temperatura (pasos 2.4 y 2.8).PRECAUCION: Todos los siguientes pasos hasta 2.10 implican el manejo de líquido caliente. Use el equipo de protección personal adecuado, incluidos los guantes y gafas con aislamiento térmico. Añadir 15 L de agua desionizada al baño de agua y calentar el líquido a 70 oC. Coloque un cubo de 10 L lleno de 5 L de agua desionizada en un agitador magnético. Añadir fosfato sódico a una concentración final de 120 mM. Ajuste el pH a 8,14 utilizando ácido clorhídrico de 10 M. Cuando todos los componentes se hayan disuelto, añada el tampón de blanqueo concentrado resultante (5 L) al baño de agua del paso 2.2. Agitar el baño de agua hasta que la temperatura alcance los 70 oC. Utilice ácido clorhídrico de 10 M para ajustar el pH a 8,14 si es necesario. Continúe agitando durante al menos 15 minutos después de alcanzar la temperatura y el pH requeridos para asegurarse de que todo el conjunto está en equilibrio térmico. Preparar un cubo de 20 L (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) lleno de agua desionizada a una temperatura de 17 oC (obligatorio para el paso 2,9). Preparar 400 g alícuotas de las hojas de tabaco cosechadas del paso 1.3. Coloque una alícuota en una cesta perforada (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; anchura de los poros al menos 0,02 m x 0,02 m). Evite llenar en exceso la cesta con material vegetal o empacar las hojas demasiado apretado para evitar dañar el tejido. Sumerja completamente la cesta en el tampón de blanqueo caliente del paso 2.4 y asegúrese de que todas las hojas permanezcan bajo la superficie líquida. Utilice una cuchara de silicona termoestable para mantener las hojas bajo la superficie si es necesario. Incubar las hojas de tabaco durante 1,5 minutos en el líquido blanqueador mientras la bomba sigue agitando el líquido. Controlar la temperatura del líquido durante todo el período de incubación. Evite bloquear la entrada de la bomba con hojas de tabaco. Retire la cesta de hojas de tabaco del tampón de blanqueo y drene el tampón residual de las hojas durante 30 s. Transfiera la cesta al cubo lleno de agua fría (del paso 2.5) y sumerja las hojas durante 30 s. Retire la cesta y drene el agua residual de la le le aves para 30 s antes de la homogeneización (paso 3). Repita los pasos 2.6 a 2.9 con alícuotas frescas desde 2.6 hasta que se procese toda la biomasa cosechada. Monitoree y ajuste constantemente el pH y la temperatura del tampón de blanqueo en el baño de agua.NOTA: El material vegetal blanqueado se puede almacenar en hielo durante un máximo de 30 minutos cuando se requieren varios ciclos de blanqueo para procesar toda la biomasa. Las hojas blanqueadas también se pueden almacenar en bolsas selladas al vacío a –80 oC durante al menos 3 semanas. Sin embargo, se recomienda un procesamiento inmediato porque el almacenamiento prolongado puede reducir el rendimiento de DFE. 3. Extracción y clarificación de proteínas PRECAUCION: Los siguientes pasos implican una licuadora con cuchillas giratorias. No trabaje en el recipiente de la licuadora cuando esté encendido o montado en la unidad de motor. Colocar 150 g (masa húmeda) de hojas de tabaco blanqueadas (paso 2.9) en el recipiente de la licuadora y añadir 450 ml de tampón de extracción (50 mM de fosfato sódico, 500 mM de cloruro sódico, 10 mM de disulfito sódico, pH 7,5). Cierre bien la tapa de la licuadora para evitar el derrame de material vegetal o tampón. Homogeneizar las hojas durante 3x durante 30 s, con 30 s roturas entre cada pulso. Asegúrese de que todas las hojas estén homogeneizadas y que ninguna se pegue a la parte superior del recipiente de la licuadora. Si es necesario, abra la licuadora durante los descansos y empuje hacia abajo las hojas que se pegan en la parte superior del recipiente, usando una cuchara de silicona limpia. Después de la homogeneización, tomar una muestra de 1,0 ml del homogeneato para su posterior análisis (paso 7). Recoger el homogeneato en un recipiente de tamaño adecuado (por ejemplo, si se trabaja con una biomasa total de 1,0 kg, utilice un recipiente con una capacidad de al menos 5 L). Repita los pasos 3.1 a 3.3 hasta que se homogeneice toda la biomasa blanqueada. Monte un filtro de bolsa en un soporte de filtro y coloque otro recipiente de tamaño adecuado (véase 3.4) debajo del ensamblaje. Aplique el homogeneizador en el filtro de la bolsa a una velocidad de 0,15 L min-1. Tomar muestras del filtrado de bolsa después de cada litro para su posterior análisis (paso 7) y medir la turbidez de la piscina de filtrado de bolsas como una dilución 1:10 en tampón de extracción utilizando un turbidimetro o dispositivo similar. Aclare aún más la piscina de filtrado de bolsas utilizando 0,02 m2 de una combinación de capa de filtro de profundidad K700 (superior) y KS50 (abajo) por litro de piscina de filtrado de bolsa. Aplicar un caudal de 3,0 L min-1m-2 hasta una presión máxima de 0,2 MPa. A continuación, elimine las partículas residuales pasando el filtrado clarificado a través de un filtro estéril de 0,2 m como se describió anteriormente5. 4. Purificación del Ligando de Afinidad DFE Preparar un sistema rápido de cromatografía líquida proteica mediante el lavado con tampón de elución (fosfato sódico de 10 mM, imidazol de 300 mM, pH 7,4), tampón de lavado (10 mM de fosfato sódico, pH 7,4) y tampón de equilibrio (fosfato sódico de 20 mM, cloruro sódico de 500 mM, pH 7,4). Montar una columna que contenga 50 ml de resina de agarosa reticulada queládica por kilogramo de biomasa de la hoja (filtrado de profundidad de 2,5 L). Cargue la columna con iones de níquel aplicando 5 volúmenes de columna (CV) de solución de sulfato de níquel de 200 mM y lávela con 5 CV de tampón de elución. Utilice un caudal de 50 cm h-1 y supervise las señales UV a 260, 280 y 558 nm para todos los pasos posteriores de la cromatografía. Equilibrar la columna con 10 CV de búfer de equilibrio. A continuación, cargue 50 CV del extracto de planta clarificada (del paso 3.6) en la columna acondicionada. Lave la columna con 10 CV de tampón de lavado. Eluir la proteína de fusión DFE con búfer de elución de 5 CV y recoger la fracción que contiene el producto una vez que las señales UV a 280 nm y 558 nm han aumentado a más de 5 mAU por encima de la línea de base. Tome una muestra de 0,2 ml de la fracción de elución para medir la concentración total de proteína soluble (TSP) (paso 7.1), la concentración de DFE (pasos 7.2 y 7.3) y la pureza de DFE (paso 7.4). Monte una columna que contenga 50 ml de resina de dextran reticulada en un sistema de cromatografía. Equilibrar la columna con 5 CV de tampón de acoplamiento (200 mM HEPES, 500 mM de cloruro sódico, pH 8,5). Inyectar 10 ml de la fracción de elución DFE (paso 4.4) para el intercambio de búferes y supervisar la absorbancia UV a 280 y 558 nm. Recoja la fracción que contiene DFE una vez que las señales UV a 280 nm y 558 nm hayan aumentado a más de 5 mAU por encima de la línea de base. Tome una muestra de 0,2 ml y determine la concentración de TSP, la concentración de DFE y la pureza de DFE (paso 7). Concentrar la muestra de DFE purificada (del paso 4.7) a 15 g de L-1 utilizando un tubo concentrador concentrador a 3.000 x g a 4 oC durante 30 minutos en una centrífuga. Continúe con la reacción de acoplamiento (paso 5).NOTA: Almacene la solución DFE a 4 oC si los pasos de concentración o acoplamiento no se pueden llevar a cabo inmediatamente. 5. Acoplamiento dFE a la resina de agarosa reticulada activada NOTA: No reemplace el isopropanol utilizado para el almacenamiento de columnas activadas por el NHS hasta que todos los equipos y soluciones para el acoplamiento estén listos. Nunca deje que las columnas se sequen. Configurar un modelo de diseño de experimentos (DoE) para optimizar el acoplamiento de DFE a la resina activada, con pH, composición tampón y concentración de DFE como factores. Los detalles del método DoE se describen en otro lugar15. Preparar la solución de ligando de afinidad (del paso 4.8) en un rango de concentración de 0,5–15 g L-1 o según se define en el DoE y guárdelo en hielo hasta que la reacción de acoplamiento esté lista (paso 5.5). Llene al menos diez jeringas de 2 ml con la solución DFE y prepare un adaptador para montar las jeringas en columnas de agarosa reticuladas activadas por el NHS con un volumen de cama de 1,0 ml. Por cada 10 columnas utilizadas para el acoplamiento, prepare 30 ml de solución de desactivación (0,5 M de etanolamina, cloruro sódico de 0,5 M, pH 8,3), 30 ml de solución de pH bajo (0,1 M de acetato de sodio, cloruro sódico de 0,5 M, pH 4,0) y 10 ml de solución de almacenamiento (0,05 M de fosfato disódico (0,05 M de fosfato disódico , 0,1% (m/v) azida sódica, pH 7,0). Preparar 20 ml de ácido clorhídrico de 1 ml en un tubo e incubarlo en hielo durante al menos 20 minutos. Prepare una báscula de precisión para monitorear las fracciones de flujo durante todos los pasos durante la reacción de acoplamiento (paso 5.7). Abra una columna de agarosa reticulada activada por NHS sellada y monte el adaptador de jeringa en la entrada de la columna. Evite que entre aire en la columna aplicando una gota de tampón en la entrada del adaptador antes de conectarlo a la jeringa. Lavar la columna con 6 ml de ácido clorhídrico de 1 ml de hielo (del paso 5.4) a un caudal de <1 mL min-1 y proceder inmediatamente al paso 5.7. Inyectar 1,5 ml de solución DFE (paso 5.2) utilizando una jeringa de 2 ml a un caudal de <1 ml min-1 y recoger la fracción de flujo en una escala de precisión (paso 5.4) para su posterior análisis (paso 7). Sellar la columna en ambos extremos e incubar durante 15-45 min a 22 oC, dependiendo de la configuración del DoE. Inyectar 6 ml de solución de desactivación seguido de 6 ml de solución de bajo pH a un caudal de <1 ml min-1 para eliminar los ligandos no unidos covalentemente de la resina. A continuación, inyectar 6 ml de solución de desactivación e incubar la columna durante 15 min. Inyectar 6 ml de solución de pH bajo en la columna, seguido de 6 ml de solución de desactivación. A continuación, inyecte otros 6 ml de solución de pH bajo en la columna. Inyectar 2 ml de solución de almacenamiento en la columna y almacenar a 4 oC. 6. Prueba de la purificación de mAbs a partir de extractos de plantas aclaradas Preparar 100 ml de extracto vegetal clarificado que contenga 2F55 o el sobrenadante del sistema de expresión a base de células preferido, que también contiene 2F5. Preparar el tampón de equilibrio (20 mM de fosfato sódico, cloruro sódico de 500 mM, pH 7,4), tampón de elución de baja pH (0,05 M citrato, cloruro de sodio de 0,05 M, pH 4,0–3,25) y tampón de elución de alta resistencia iónica (cloruro de magnesio de 1,0–4,0 M, 0,1 M HEPES, pH 8.0) Enjuague el sistema de cromatografía con los buffers. Monte una columna de afinidad DFE (del paso 5.10) en el sistema de cromatografía y equilibre con 5 CV de búfer de equilibrio a un caudal de 1,0 ml min-1. Supervise la absorbancia UV a 280 nm.NOTA: La carga de extracto de planta o sobrenadante de cultivo celular en la columna puede causar un aumento en la contrapresión. Establezca una alerta de alta presión en 0,2 MPa para evitar daños en el sistema de cromatografía o en la columna DFE. Cargar 80 ml del extracto de planta clarificada o sobrenadante (paso 6.1) sobre la columna a un caudal de 0,5 ml mín.1 para garantizar un tiempo de contacto de 2 min. Recoger las muestras de flujo en fracciones de 2 ml para la reconstrucción de la curva de ruptura (paso 7.3). Almacene las muestras de flujo a través de 4 oC si no es posible realizar un análisis inmediato de la muestra. Lave la columna con 6 CV de búfer de equilibrio. Recoja una muestra del lavado al principio, al medio y al final de este paso. Elute mAb 2F5 con 5 CV de tampón de elución de baja pH o tampón de elución de alta resistencia iónica (0,1 M HEPES, cloruro de magnesio de 1,25 M, pH 8,0). Recoja la fracción DFE cuando la señal UV 280 nm ha aumentado a 5 mAU por encima de la línea de base. Optimice el tampón de elución para cada par de epítopos y anticuerpos. Para 2F5, 1,25 M cloruro de magnesio logró un equilibrio óptimo entre la recuperación del producto y la estabilidad de los ligandos.NOTA: La solución de cloruro de magnesio es propensa a la precipitación. Por lo tanto, disolver el cloruro de magnesio en 700 ml de agua. Disolver por separado el HEPES en 100 ml de agua y ajustar el pH a 8,0. Añadir la solución de cloruro de magnesio disuelto a la solución HEPES y añadir agua a un volumen final de 1,0 L. No ajuste el pH después de disolver el cloruro de magnesio porque esto causará precipitación. Analice todas las muestras tomadas durante los pasos 6.4–6.6 utilizando el método Bradford, la electroforescopia de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de litio (LDS-PAGE) y la espectroscopia de resonancia plasmón superficial (SPR) (paso 7). 7. Análisis de muestras Mida la concentración de TSP utilizando el métodoBradford 18,19. En triplicado, pipeta de 2,5 ml de cada muestra en un solo pozo de una placa de 96 pocillos. Utilice ocho normas de albúmina sérica bovina (BSA) en triplicado que cubra el rango de 0 a 2.000 mg L-1. Añadir 200 l de reactivo Bradford a cada pocal y mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Mantenga el nivel de pipeta para evitar la formación de burbujas que distorsionan la lectura posterior. Incubar la placa durante 10 min a 22 oC y medir la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro. Calcule la concentración de TSP en las muestras basándose en una curva estándar a través de los puntos de referencia de BSA. Cuantificar DFE por fluorurometría En triplicado, pipeta de 50 ml de cada muestra en pozos individuales de una placa negra de 96 pocillos de media zona. Incluya seis estándares DsRed que cubran el rango de 0–225 mg L-1. Mida la fluorescencia dos veces utilizando un filtro de excitación de 530 x 30 nm y un filtro de emisión de 590 a 35 nm en un espectrofotómetro. Calcule la concentración de DFE en las muestras basándose en una curva estándar a través de los puntos de referencia DsRed. Mida la concentración 2F5 por espectroscopia SPR20. Preparar el tampón de circulación HBS-EP (10 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 3 mM de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), cloruro de sodio de 150 mM, 0.005% v/v Tween-20, pH 7.4) y filtrarlo pasándolo a través de un vacío de 0.2m filtro de la tapa de la botella. Desgasifique el buffer durante 15 min. Conecte el búfer de funcionamiento HBS-EP al instrumento SPR antes de acoplar un chip de superficie de dextran carboximetilado y equilibre el sistema utilizando la función prime. Inicie un ciclo manual con un caudal de 30 ml min-1 y acondicione la superficie de la viruta inyectando alternativamente ácido clorhídrico de 30 mM e hidróxido de sodio de 25 mM (dos inyecciones cada una) sobre las células de flujo 1 y 2 a un caudal de 30 ml min-1 durante 1 min. Preparar 300 s de un 500 mg L-1 Proteína A en acetato de sodio de 10 mM (pH 4.0). Viales de descongelación que contienen 0,4 M 1-etil-3-(3-dimetilaminopropyl) clorhidrato de carbodiimida (EDC) y 0,1 M de NHS y centrífuga a 16.000 x g durante 1 min antes de mezclar 70 ml de EDC y 70 ml de NHS. Transfiera la mezcla EDC/NHS y la solución de proteína A a viales de muestra de plástico de 7 mm y colóquela en el estante de la muestra. Active la superficie de la viruta de dextran carboximetilada inyectando la mezcla EDC/NHS sobre las celdas de flujo 1 y 2 a un caudal de 10 l min-1 durante 10 min. Acople la proteína A a la superficie de dextran carboximetilada activada inyectando la solución de proteína A sobre la celda de flujo 2 a un caudal de 15 l min-1 durante 15 min. Durante el acoplamiento de la proteína A, descongelar un vial de 1,0 M de clorhidrato de etanolamina (pH 8,5) y centrifugar a 16.000 x g durante 1 min. Transfiera 150 ml a un vial de plástico de 7 mm y colóquelo en el instrumento. Cuando se complete el paso 7.3.5, desactive la superficie de la viruta inyectando la solución de etanolamina sobre las células de flujo 1 y 2 a un caudal de 10 l min-1 durante 7 min. Acondicionar la superficie de la viruta inyectando alternativamente ácido clorhídrico de 30 mM y 25 mM de hidróxido de sodio (dos inyecciones cada una) sobre las células de flujo 1 y 2 a un caudal de 30 ml min-1 durante 0,5 min. Preparar las normas de los anticuerpos 2F5 en el tampón de funcionamiento HBS-EP a una concentración de 500 g L-1 y muestras diluidas que contengan 2F5 en HBS-EP a una concentración final en el rango de 20–1.000 g L-1. Inyectar muestras y estándares sobre las celdas de flujo 1 y 2 a un caudal de 30 l min-1 durante 3 min. Inyectar un estándar 2F5 después de cada 15 muestras. Restar la señal de unidades relativas (RU) de la celda de flujo 1 (célula de referencia) de la señal de la celda de flujo 2 (célula de medición) para cada muestra y calcular la concentración de anticuerpos en función de la señal RU de las inyecciones estándar 2F5. Después de cada muestra o inyección estándar, regenere la superficie de la viruta inyectando ácido clorhídrico de 30 mM a un caudal de 30 ml min-1 durante 0,5 minutos sobre las celdas de flujo 1 y 2. Trazar la concentración 2F5 para cada muestra de flujo a través del paso 6.4 contra el flujo a través del volumen para obtener la curva de ruptura 2F5. Calcular la cantidad de 2F5 inyectado cuando se alcanzó el 10% de la concentración de carga 2F5 para obtener la capacidad de unión dinámica (DBC) del 10%. Analice las muestras de proteínas por LDS-PAGE. Abra un gel de poliacrilamida BisTris LDS listo para usar 4–12% y colóquelo en un módulo de electroforesis. Transfiera 800 mL de tampón en funcionamiento (50 mM MES, base Tris de 50 mM, SDS 0,1% (m/v), EDTA de 1 mM, pH 7,3) al módulo y añada 0,5 ml de solución antioxidante. En un tubo de reacción de 1,5 ml, mezcle 10 ml de tampón de carga con 4 ml de agente reductor y 26 ml de la muestra de proteína. Incubar el tubo en un bloque de calor durante 10 min a 80oC. Centrifugar el tubo a 500 x g durante 30 s. Cargue el gel de poliacrilamida SUD (10 ml de muestra por carril) y cargue 5 ml de proteína preteñida estándar (10-180 kDa) en un carril separado. Cierre la cámara de electroforesis y conecte la fuente de alimentación. La electroforesis debe funcionar durante 40 min y a 200 V constante. Retire el gel de la cámara de electroforesis. Abra la revestimiento de gel y lave el gel durante 15 minutos en agua sobre una coctelera a 19 rpm. Manchar el gel durante 1 h en solución de tinción en una coctelera a 19 rpm. Destain el gel durante 1 h en agua en una coctelera a 19 rpm. Escanee el gel con un escáner de película fotográfica.

Representative Results

Expresión y purificación del ligando de afinidad La proteína de fusión DFE se expresa bañaba en plantas de tabaco transgénicas cultivadas en un invernadero. El rendimiento fue de 120kg-kg -1 de masa de hoja con una biomasa media de 130 g por planta. La pureza de DFE fue 97% de las proteínas de las células huésped. El paso de blanqueo se integró fácilmenteen la rutina de recolección y extracción (Figura 1) y tomó menos de 2 h de tiempo extra, incluyendo la instalación del baño de agua. La recuperación global de DFE fue de 23,5 mg kg1 con una pureza de >90%. Los pasos responsables de la pérdida de producto fueron blanqueamiento, filtración de profundidad e IMAC, con pérdidas específicas del 40%, 27% y 45%, respectivamente. La capacidad del filtro de profundidad fue, en promedio, de 135 a 36 L m-2 (SD, n.o 3) y, por lo tanto, en el rango superior de valores indicados en la literatura21. El rendimiento de DFE aumentó con la edad de la planta (Figura2). Inmovilización del ligando de afinidad en columnas de cromatografía activadas por el NHS Durante las pruebas de acoplamiento iniciales, descubrimos que el tampón HEPES (pH 8.3) aumentó la eficiencia del acoplamiento a 89 a 6 % (SD, n-3) en comparación con el 78 o 9 % (SD, n.o 3) para el tampón de bicarbonato recomendado por el fabricante. Por lo tanto, HEPES se utilizó para todos los experimentos de acoplamiento posteriores. Se seleccionó un enfoque DoE para optimizar la eficiencia de acoplamiento de DFE a resina de agarosa reticulada activada por NHS. La cantidad absoluta de DFE inmovilizada en la resina aumentó con la masa de DFE inyectada en la columna y meseta a 15 g L-1 mientras que el rendimiento del acoplamiento disminuyó continuamente a medida que se inyectaba más DFE (Figura2). El rendimiento del acoplamiento también fue >50% inferior en un tampón ácido, lo que indica la necesidad de realizar la prueba de las condiciones de acoplamiento adecuadas para cada ligando caso por caso. Las condiciones ideales en términos de rendimiento de acoplamiento, cantidad absoluta de DFE inmovilizado y costos de columna se identificaron utilizando la herramienta de optimización numérica del software DoE. Las condiciones más deseables (pH 9,0 y 7,0 mg de DFE por 1 ml de resina de agarosa reticulada) se encontraban en una meseta grande y, por lo tanto, eran robustas. Las moléculas de DFE conservaron su fluorescencia roja incluso después del acoplamiento, y la intensidad del color correspondió a la cantidad total de DFE inmovilizado (Figura2). Por lo tanto, el color de la columna se puede utilizar como un parámetro de control de calidad simple para estimar la eficiencia del acoplamiento y la calidad de la columna. La fluorescencia también confirmó que la proteína de fusión DFE se ensamblaba en el estado tetramrica de DsRed nativo. Figura 2: Optimización de la inmovilización de DFE a la resina de agarosa reticulada activada por el NHS. (A) Gel LDS-PAA con superposición de manchas occidentales de muestras de homogeneidad y elución de extractos de plantas DFE transgénicas sin blanquear y blanqueadas. La cosecha de plantas se realizó 38, 45 o 52 días después de la siembra. Las manchas occidentales se realizaron utilizando un anti-His6-anticuerpos5. (B) Cantidad total de ligando de afinidad DFE acoplado en dependencia si el pH de acoplamiento y la masa total de DFE purificado se inyectaen en columnas de agarosa reticuladas activadas por el NHS. Los puntos rojos indican los experimentos reales realizados para crear el modelo de superficie de respuesta. (C) Columnas de afinidad DFE después del procedimiento de acoplamiento. Los números corresponden a las condiciones de acoplamiento resaltadas en el panel B. dps – días posteriores a la sembración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Prueba del aislamiento 2F5 con la resina de afinidad DFE El anticuerpo 2F5 recombinante se produjo transitoriamente en plantas de Nicotiana benthamiana cultivadas en un fitotrón5. La captura de 2F5 a partir del extracto de planta bruta se probó utilizando columnas de afinidad junto con DFE purificado de 7,0 mg de mg (paso 6). La elución de resinas de proteína A generalmente implica un tampón ácido (pH n.o 3,3)13. Por lo tanto, evaluamos inicialmente diferentes búferes de elución de pH bajo (pH 6.0–3.25) para las columnas DFE. La elución de 2F5 tuvo éxito con valores de pH inferiores a 4,5, con la recuperación más alta del 35 % a pH 3,25. Sin embargo, la elución de pH bajo inactivó tanto el anticuerpo (como lo confirma la espectrometría SPR) como el ligando DFE (como lo indica la pérdida de color y el DBC inferior, Figura 3). Este último se anticipó dado que dsRed nativo desnaturaliza en pH <4.022,23. Para evitar la desnaturalización del producto y el ligando, probamos el cloruro de magnesio como agente de elución alternativo porque se ha utilizado previamente para eludar mAbs de otras resinas de afinidad24. Una concentración de cloruro de magnesio de 1,25 M fue suficiente para eluir 2F5 de la resina de afinidad DFE con una recuperación de 105 a 11% (SD, n.o 3) y una pureza de 97 a 3% (SD, n.o 3). Este rendimiento fue comparable a las resinas de proteína A25,26. La constante de disociación de equilibrio (KD) del anticuerpo 2F5 purificado por DFE y el ligando sintético Fuzeon fue de 791 pM, mientras que la de una contraparte purificada por proteínas A fue de 763 pM5. Además, no se observó una pérdida de color sustancial en la resina durante un total de 25 ciclos de unión y eluto. El DBC de la resina de afinidad DFE en el 10% 2F5 de ruptura disminuyó linealmente en el transcurso de 25 ciclos a -15% del valor inicial (Figura3). Figura 3: Prueba del aislamiento de 2F5 de extractos de plantas clarificadas utilizando las resinas de afinidad DFE. (A) Resinas de afinidad DFE después de un ciclo de elución utilizando tampones con diferentes valores de pH en el rango 4.0–3.0 y las mismas resinas después de un paso de neutralización a pH 6.0. (B) Resinas de afinidad DFE después de uno y seis ciclos de purificación 2F5 utilizando 1,25 M o 4,00 M de cloruro de magnesio como eluyente. (C) Cromatógramas de experimentos de carga frontal (curvas de rotura) para determinar la capacidad de unión dinámica dependiente del ciclo de resina DFE utilizando cloruro de magnesio como eluyente. Las curvas de ruptura se midieron para 4,0 M y 1,25 M de elución de cloruro de magnesio y varios números de ciclo. (D) Capacidad de unión dinámica dependiente del ciclo de DFE utilizando cloruro de magnesio de 1,25 M como eluyente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aplicaciones de la novedosa resina de afinidad

Hemos demostrado que las resinas de cromatografía de afinidad personalizadas para la captura de mAbs se pueden fabricar inmovilizando un ligando que contiene un epítopo específico de mAb a agarosa reticulada activada por el NHS. Para diseñar una resina de este tipo, era necesario conocer la secuencia del epítopo y utilizar un epítopo lineal. Las resinas resultantes son ventajosas para la captura de mAbs porque potencialmente podrían reemplazar costosas etapas de cromatografía de afinidad de proteína A. La interacción entre 2F5 y DFE en nuestro estudio de caso fue mediada por la unión epítopo-paratopo, por lo que nuestro ligando debe ser más selectivo que la proteína A, que se une a la región Fc de la mayoría de los IgG muriyenos. Debido a que se necesitan ligandos individuales para cada mAb, nuestro método puede parecer inicialmente adecuado principalmente para anticuerpos que se producen a gran escala. Sin embargo, al combinar nuestro enfoque con la expresión rápida de proteínas transitorias a base de plantas, se pueden preparar nuevos ligandos de afinidad en menos de 2 semanas²⁷ con un esfuerzo mínimo^{de 28.} Por lo tanto, el método también es adecuado para la purificación de mAb a pequeña escala.

Producción y posibles mejoras del ligando de afinidad

Las plantas ofrecen una plataforma deproducción rápida y segura para ligandos de afinidad 5,^29,^30,como la proteína de fusión DFE que aparece en nuestro caso práctico. El blanqueamiento del material vegetal redujo en gran medida la cantidad de proteínas de células huésped en un solo paso y se integró fácilmente en una rutina de clarificación estándar. Sin embargo, la recuperación del ligando fue baja en la configuración actual, probablemente debido a su moderada estabilidad térmica y alguna unión no específica a las capas de filtro, como se informó para otros productos³¹^,³²^,³³. Por lo tanto, la ingeniería del portador para aumentar su estabilidad térmica puede ayudar a mejorar el rendimiento del ligando en el futuro, como se describe para la vacuna contra la malaria candidata CCT, la enzima antitumoral PpADI o una mesofílica -glucosidasa³⁴^, ³⁵^,³⁶. Lo mismo se aplica para el paso de filtración de profundidad, donde la ingeniería de proteínas puede ayudar a reducir la unión no específica al material filtrante³⁷. Los costes de producción de DFE y ligandos similares también podrían reducirse mejorando la eficiencia general de la clarificación utilizando floculantes o aditivos filtrantes³⁸^,³⁹.

Cuando DsRed se utiliza como portador, forma un complejo tetramírico. Esto es ventajoso porque aumenta el número de epítopos por ligando, pero también puede hacer que el ligando sea más susceptible al desmontaje o desnaturalización durante la cromatografía de afinidad. Por lo tanto, puede ser preferible una proteína portadora monomérica como mCherry, ya que es estable a un pH bajo^{de 40,}y la inclusión de repeticiones en tándem del epítopo aumentaría la avidez del ligando y, por lo tanto, aumentaría la capacidad de resina⁵^, ²⁶ ^, ⁴¹. Para proteínas simples portadoras-epítopos (es decir, aquellas sin enlaces dissulfuros o modificaciones post-traduccionales), los sistemas de producción microbiana pueden reducir los costos de fabricación y hacer que los ligandos sean más competitivos con la proteína A. Por ejemplo, la proteína fluorescente verde se ha expresado en células bacterianas con un rendimiento de 1 kg de peso^-1 de biomasa, lo que reduciría significativamente los costes de producción de ligandos^42.

Independientemente del host de expresión, se requería un ligando de afinidad purificado durante el acoplamiento para minimizar la inmovilización de proteínas de células huésped o componentes de medios que de otro modo podrían reducir la selectividad y la capacidad de resina. La inclusión de una etiqueta de polihistidina para la purificación IMAC aumentó la pureza al 90% en un solo paso, facilitando una producción rápida y económica de ligandos⁵^,⁴³^,⁴⁴. Sin embargo, la posición de la etiqueta de fusión es importante porque tiene el potencial de obstaculizar stericamente la unión de epítopos o para inducir el escote de la etiqueta o el epítopo del portador⁴⁵^,⁴⁶.

Inmovilización del ligando de afinidad en columnas de cromatografía activadas por el NHS

La inmovilización se llevó a cabo manualmente o utilizando un sistema de cromatografía. Los pequeños volúmenes de búfer por columna parecían favorecer la manipulación manual (por ejemplo, debido a los volúmenes mínimos de residuos). Sin embargo, si se necesitan columnas múltiples/más grandes, el sistema de cromatografía facilita el control de las condiciones de acoplamiento (por ejemplo, caudales regulados) y, por lo tanto, es más probable que obtenga resultados reproducibles en términos de DBC. Nuestros datos sugieren que el búfer de acoplamiento y el pH tienen un efecto importante en la eficiencia del acoplamiento y los costos generales de las columnas. Por lo tanto, los factores de cribado que influyen en la reacción de acoplamiento y su ajuste para cada proteína portadora (o incluso para cada fusión portadora-ligand) podrían mejorar la eficiencia del acoplamiento y el rendimiento de la resina, y recomendamos este enfoque.

Prueba del aislamiento 2F5 con la resina de afinidad DFE

El rendimiento y la pureza del producto son aspectos importantes del rendimiento de la resina, y en el caso de DFE logramos un rendimiento de 105 a 11% (SD, n-3) y una pureza de 97 a 3% (SD, n-3), que es comparable con el rendimiento de las resinas de referencia de proteína A²⁵ ^,²⁶. Otro indicador clave de rendimiento para las resinas en general (y particularmente para aquellas basadas en ligandos de afinidad) es el DBC en el 10% de avance del producto, ya que este parámetro afecta a la cantidad de resina necesaria para un proceso específico y, por lo tanto, a los costos. Para el ligando DFE, el DBC inicial era de 4 g L^-1 resina, que es el 13% del valor correspondiente para la proteína A en condiciones similares (sólo 2 min de tiempo de contacto)²⁵^,⁴⁷ pero aproximadamente 15 veces más alto en comparación con otras resinas de afinidad personalizadas como la ligando anti-FSH-inmunoafinidad utilizando el mismo tiempo de residencia de 2 min⁴⁸. El DBC de DFE disminuyó al 15% del valor inicial después de 25 ciclos de unión y eluto, mientras que se requieren más de 50 ciclos para la misma pérdida de DBC en resinas comerciales de proteína A^49. Sin embargo, es importante tener en cuenta que nuestro transportista aún no ha sido optimizado en la misma medida que la proteína A, que ha sido investigada y mejorada exhaustivamente en las últimas cuatro décadas⁸.

Hasta ahora hemos mejorado la estabilidad de la resina y la recuperación del producto al cambiar de un tampón de elución de bajo pH a una alta concentración de cloruro de magnesio (Figura3), como se recomendó en estudios anteriores¹³. El característico color rojo del ligando de afinidad no se desvaneció sustancialmente durante los 25 ciclos de unión y eluto, por lo que especulamos que las proteasas vegetales endógenas en los extractos vegetales clarificados³¹ pueden haberse truncado y, por lo tanto, inactivado el epítopo de el ligando. Por lo tanto, el diseño de enlaces resistentes a la proteasa para conectar el portador y el epítopo puede ayudar a mantener el DBC inicial durante un número prolongado de ciclos. Dada la rápida y sencilla expresión y purificación del ligando DFE, su acoplamiento directo a las resinas de cromatografía comercial, y su excelente rendimiento y pureza del producto, creemos que nuestro método ofrece una alternativa adecuada a la Proteína A para el purificación de mAbs y derivados de anticuerpos que no se unen a la proteína A, especialmente si las mejoras en el portador y el vinculador pueden mejorar el DBC y la estabilidad del ligando. Esta suposición fue apoyada por la pequeña diferencia en la constante de disociación de DFE-purificado y proteína A-purificado 2F5 anticuerpo⁵, lo que indica que nuestro nuevo ligando de afinidad permite la recuperación de mAbs de alta calidad.

Beneficios y limitaciones actuales del método

Producir el ligando de afinidad como fusión genética con una proteína portadora aumenta la solubilidad en los tampones acuosos y, por lo tanto, la compatibilidad con las condiciones típicas de acoplamiento de ligandos. Por el contrario, los péptidos en blanco derivados de la síntesis de péptidos de fase sólida pueden tener solubilidad limitada en estas condiciones debido a su secuencia^50,que no se puede cambiar porque está dictada por la secuencia de aminoácidos del epítopo reconocida por el mAb a ser purificado. Otros han utilizado por lo tanto unasíntesis en resina de ligandos peptídor51 . La capacidad de unión estática de la resina resultante fue alta (80 g L^-1), pero el proceso de preparación de la resina es largo, no se informó de una capacidad de unión dinámica y la pureza y recuperación obtenidas fueron menores que en nuestro enfoque. Una ventaja adicional de un ligando de proteína de fusión en escala de laboratorio es que el ligando y sus variantes se pueden producir, purificar y probar rápidamente con el mínimo esfuerzo en un sistema de expresión de alta distancia fácil de usar⁵².

Las dos limitaciones de corriente del método que se presenta aquí son la baja capacidad de unión dinámica de 3 g L^-1 y su reducción del 90% en el transcurso de 25 ciclos de enlace y eluto⁵. Estas limitaciones se pueden abordar en el futuro aplicando condiciones de carga menos estrictas y reemplazando el portaaviones DsRed actual por una variante de ingeniería más estable, respectivamente. Por ejemplo, duplicar el tiempo de contacto actual de 2 a 4 minutos tiene el potencial de duplicar la capacidad de unión dinámica como se mostró para algunas resinas de proteína A^26.

Solución de problemas

En la tabla siguiente se destacan los posibles problemas que se pueden encontrar durante este protocolo y se proporcionan sugerencias sobre cómo resolverlos (Tabla 1).

Tabla 1: Posibles problemas que se pueden encontrar y posibles correcciones.
Paso del protocolo	Problema	Couse	Arreglar
1	Las plantas no crecen	Condiciones de crecimiento comprometidas	Comprobar el pH y la conductividad del fertilizante
			Compruebe las condiciones de temperatura y luz
2 y 3	Grandes cantidades de proteínas de células huésped están presentes después de la extracción	Precipitaciones incompletas	Compruebe la temperatura durante el blanqueamiento
			Compruebe la agitación en el baño blanqueado
2 y 3	No se ha encontrado ningún producto en el extracto de la planta	Temperatura de blanqueo demasiado alta	Comprobar la temperatura y el pH durante el blanqueamiento
		pH en el tampón de blanqueo demasiado bajo
3	Las partes grandes del tallo o de la hoja permanecen después de la extracción	Mezcla incompleta en licuadora	Asegúrese de que el material vegetal no forme un enchufe en la licuadora
3	Aumento rápido de la presión durante la filtración de profundidad	Selección y/o orientación incorrecta del filtro	Compruebe el tipo de filtro y la orientación
4	Pequeña proteína de fusión durante la elución / una gran cantidad de proteína de fusión en flujo a través	La resina IMAC no se cargó con iones metálicos	Compruebe si la resina IMAC se cargó correctamente con iones
		La proteína de fusión perdió la etiqueta de afinidad	Evite la luz solar intensa y las altas temperaturas durante el cultivo de las plantas
4	Proteína de fusión perdida durante la concentración	Proteína de fusión unida a la membrana	Compruebe el tipo de membrana
			Asegúrese de que el factor de concentración no fuera demasiado alto
5	Bajo rendimiento de acoplamiento	Secuencia incorrecta de adición de reactivos de acoplamiento	Compruebe las etiquetas de los reactivos y la secuencia de adición
		Preparación incorrecta de las columnas antes del acoplamiento	Compruebe las condiciones de la preparación de la columna
5 y 6	Bajo rendimiento de mAb	Baja expresión de mAb en la biomasa vegetal	Prueba de expresión de mAb en biomasa
		Baja densidad de ligando	Compruebe la pureza de la preparación de proteínas de fusión
7	Concentraciones de proteínas muy bajas/altas en el ensayo Bradford	Formación de burbujas durante el pipeteo	Compruebe si hay burbujas en el palte de 96 polos
7	Baja concentración de mAb durante la medición de SPR	Proteína comprometida Un chip	Comparar con los resultados de mAb estándar con concentración conocida
		Dilución incorrecta de la muestra	Compruebe la tasa de dilución y el búfer

Tabla 1: Disparo de problemas.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría reconocer a Ibrahim Al Amedi por el cultivo de las plantas de tabaco transgénicas y al Dr. Thomas Rademacher por proporcionar el vector de expresión del tabaco. Los autores desean agradecer al Dr. Richard M. Twyman por la asistencia editorial y a Markus Sack por sus fructíferas discusiones sobre la estructura de ligandos de afinidad de DFE. Este trabajo fue financiado en parte por los Programas Internos Fraunhofer-Gesellschaft bajo la Concesión No. Attract 125-600164 y el estado de Renania del Norte-Westfalia bajo la subvención Leistungszentrum no 423 “Producción en red y adaptativa”. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en el marco del Grupo de Formación de Investigación “Entrega de medicamentos dirigido al tumor” otorgado 331065168. GE Healthcare apoyó la publicación de acceso abierto de este artículo.

Materials

10L/20L Bucket	n/a	n/a	Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
ÄKTApure	GE Helthcare	29018226	Chromatography system
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	Centrifuge
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Antibody 2G12	Fraunhofer IME	n/a	Standard for SPR quantification
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Fuhr	2632410001	Bag filter
CanoScan 5600F	Canon	2925B009	Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chelating Sepharose FF	GE Helthcare	17-0575-01	Chromatography resin
Cond 3320	WTW	EKA 3338	Conductometer
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n/a	DoE software
Discovery Compfort	Gilson	F81029	Multichannel pipette
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Diverse bottles	Schott Duran	n/a	Glas bottles
Dri Block DB8	Techne	Z381373	Heat block
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	Buffer component
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	Plate reader
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	Thermometer
F9-C	GE Helthcare	29027743	Fraction collector
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200	Hettich	2400	Centrifuge
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	Chromatography columns
Hydrochloric acid	Carl Roth GmbH	4625.1	Buffer component
Imidazole	Carl Roth GmbH	3899.2	Buffer component
K700	Pall	5302305	Depth filter layer
KM02 basic	IKA	n/a	Magnetic stirrer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Immersion circulator
Magnesium chloride	Carl Roth GmbH	KK36.2	Buffer component
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm	Sartorius	16534K	Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter	Thermo Fischer Scientific	595-4520	Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate	Carl Roth GmbH	T111.1	Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer	Invitrogen	NP0002	Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant	Invitrogen	NP0005	Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa)	Invitrogen	26616	Protein standart
Perforated bucked	n/a	n/a	Blanching
PH 3110	WTW	2AA110	PH meter
PowerPac HC	Biorad	1645052	Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	P7837-5MG	Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran	GE Helthcare	17003301	Chromatography resin
Silicone spoon	n/a	n/a	Spoon
Simply Blue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Gel staining solution
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	6773.1	Buffer component
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	X891.1	Media component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-100G	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Buffer component
Sodium citrate	Carl Roth GmbH	HN13.2	Buffer component
Sodium bisulfite	Carl Roth GmbH	243973-100G	Media component
Sodium phosophate	Carl Roth GmbH	T877.2	Media component
SPR Affinity Sensor – High Capacity Amine	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	SPR-AS-HCA	SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	n/a	SPR device
SSM3	Stuart	10034264	Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L	Clatronic	n/a	Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL	B. Braun	4606027V	Syringes
Syringe adpter (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	Syringe adapter
TE6101	Sartorius	TE6101	Precision scale
Tween-20 (Polysorbate)	Merck	8170721000	Buffer component
Unicorn 6.4	GE Helthcare	29056102	Chromatography software
Vacuum bags	Ikea	203.392.84	Plant storge
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Vortex
XK-26/20 column housing	GE Helthcare	28-9889-48	Chromtography column

Referências

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Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins – Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).