Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Matthias Kn&#246;dler; Clemens R&#252;hl; Patrick Opdensteinen; Johannes  F. Buyel

doi:10.3791/59933

JoVE Journal > Biochemistry

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Bioquímica

선호도 크로마토그래피 수지의 신속한 개발을 위한 활성화된 상호 연결 아가로스 - 사례 연구로서의 항체 포획

Published: August 16, 2019

doi:

10.3791/59933

Matthias Knödler^1,3, Clemens Rühl², Patrick Opdensteinen^1,3, Johannes F. Buyel^1,3

¹Institute for Molecular Biotechnology,RWTH Aachen University, ²Sanofi Deutschland GmbH, ³Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME,Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

Summary

이 절차에서, DsRed 계 에피토프 리간드는 단백질 A의 대안으로서 원유 식물 추출물 또는 세포 배양 과식제로부터 단일클론 항체를 포획하기 위한 고도로 선택적인 친화도 수지를 생성하기 위해 고도로 선택적인 친화도 수지를 생성한다.

Abstract

단일 클론 항체 (mAbs)의 정제는 일반적으로 전체 공정 비용의 최대 25 %를 차지 할 수있는 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 달성됩니다. 따라서 비용 효율적인 대안적인 캡처 단계는 대량의 단일 mAb가 생산되는 산업 규모의 제조에 유용합니다. 여기서 우리는 단백질 A를 사용하지 않고 원유 식물 추출물로부터 HIV 중화 항체 2F5의 선택적 포획을 허용하는 가교 아가로즈 수지로 DsRed 기반 에피토프 리간드의 고정화를 위한 방법을 제시한다. 선형 에피토프 ELDKWA는 먼저 형광 단백질 DsRed에 유전적으로 융합되었고 융합 단백질은 고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피에 의해 정제되기 전에 형질전환담배(Nicotiana tabacum)식물로 발현되었다. 또한, 활성화된 가교 아가로즈를 기반으로 하는 방법은 높은 리간드 밀도, 효율적인 커플링 및 저렴한 비용으로 최적화되었다. pH 및 완충제 조성물 및 수용성 리간드 농도는 커플링 절차 동안 가장 중요한 파라미터였으며, 이는 실험 설계 접근법을 사용하여 개선되었다. 생성된 친화성 수지는 조식물 추출물에서 표적 mAb를 선택적으로 결합하는 능력에 대해 시험되었고 용출 버퍼는 높은 mAb 회수, 제품 활성 및 친화성 수지 안정성을 위해 최적화되었다. 이 방법은 선형 에피토프를 가진 다른 항체에 용이하게 적응될 수 있다. 새로운 수지에서는 단백질 A보다 더 부드러운 용출 조건을 허용하고 mAb 생산을 위한 초기 포획 단계의 비용을 절감할 수 있습니다.

Introduction

바이오 의약품은 거의 모든 의학 분야에서 광범위한 질병 의 치료에중요합니다 1. 단일클론 항체(mAbs)가 바이오 의약품 시장을 장악하고 있으며, 2020년 전 세계 매출은 약 1,100억 유로에 달할 것으로 예상됩니다^2. mAbs에 대한 선호하는 발현 플랫폼은 일반적으로 배양 상급3,^4에서최대 10 g∙L-1의 높은 mAb 티터를 생성하는 중국 햄스터 난소 세포주이다. 그러나, 포유류 세포 배양물에서 mAbs의 생산은 배지의 높은 비용과 멸균 발효에대한 필요성 때문에 비싸다 5. 플랜트와 같은 대체 식 플랫폼은 잠재적으로 산업 제조를 위한 더 빠르고,간단하고, 저렴하고, 더 확장 가능한 접근 방식을 제공합니다 6,^7.

포유류 세포 배양과 관련된 비용 외에도 제품 포획을 위한 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 광범위한 사용은 mAbs의 산업 생산을 위한 주요 비용 동인입니다. 단백질 A는 황색포도상구균 세포의 표면에서 자연적으로 발견되며 특정 뮤린 및 인간 항체의 결정화 물질(Fc) 영역에 결합하여, 체액성 면역 체계를회피하는 방어 메커니즘으로서 작용한다 8. 단백질 A는 세포 배양 과민제로부터 mAb의 포획을 위한 산업 금본위제가 되었으며, 또한 매우 선택적이기 때문에 연구 커뮤니티에서 널리사용되고 있으며, 전형적으로 단일 단계에서 ~95%의 mAb 순도를 달성한다. 당연히, 지난 2 년 동안 단백질 A의 판매는 밀접하게mAbs 8의 판매를 반영했다 . 생산 규모에 따라, 단백질 A의 비용은 총 공정 비용의 25 % 이상에 대응할 수 있으며, 그로 인하여 치료 mAbs의 시장 가격에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 최대 € 2,000 g^-15,^9일수 있습니다. 따라서, 유사한 정제 성능을 가진 대체 크로마토그래피 수지생산 비용을 실질적으로 절감할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 항체 기반 치료법을 더 많은 수의 환자에게 접근할 수 있도록^하는10,¹¹ ^,¹². 이러한 대안은 또한 잠재적으로 응집을 촉진 하는 형태 변화를 겪고 mAbs를 일으킬 수 있는 낮은 pH (일반적으로 <3.5)에서 가혹한 용출 조건을 포함 하 여 단백질 A 크로마토그래피의 단점을 우회할 수 있습니다¹³ . 중요한 것은, 단백질 A는 특정 IgG 서브클래스의 Fc 영역에 대해서만 선택적이므로 잘린 결합 도메인을 가진 비기능성 분자는 본래 제품^5와병용화할 수 있는 반면, 단일 사슬 가변 단편과 같은 mAb 유도체는 단백질 A에 전혀 결합하지 마십시오.

여기서, 선형 에피토프 ELDKWA(1자 아미노산 코드)를 사용하여 HIV 중화 mAb 2F5의 포획을 위한 대체 친화성 크로마토그래피 수지를 5,^14에기술한다. 우리는 2F5 에피토프를 운반체 및 리포터 분자로 작용한 형광 단백질 DsRed의 C-말단에 유전적으로 융합하고, 트랜스제닉담배에서 생성된 단백질 D sRed-2 F 5-E 피토프(DFE)를 생산했습니다. 니코티아나 타바쿰)식물. DFE는 단일 단계 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 정제되었다. 정제된 DFE 친화성 리간드를 가교 아가로즈 수지 상에 고정시켜 N-하이드록시수치니마이드(NHS)를 이용한 화학적 결합에 의해 달성되었다. 통계적 실험 설계는 그 후 고정 절차 및커플링 효율(15)을 최적화하는 데 사용되었다. mAb 2F5에 대한 정제 전략은 항체 순도, 수율 및 리간드 안정성 측면에서 평가되었다. Fc 영역을 결합하는 단백질 A와 는 달리, DFE는 2F5의 상보성 결정 영역에 결합되어, 손상되지 않은 파라토프를 가진 분자의 정제를 보장한다. 우리의 개념은 선형 에피토프를 가진 임의의 mAb또는 마이크로어레이 연구^16에의해 용이하게 식별될 수 있는 다른 펩티드 계 친화도 리간드에 쉽게 적응될 수 있다.

도 1: 원유 식물 추출물 또는 세포 배양 과민제로부터 mAbs의 포획에 사용될 수 있는 에피토프 친화도 수지의 제조를 위한 공정 흐름 방식. (a) 친화성 리간드 DFE를 형질전환 담배 식물에서 발현하였다. 열 침전 단계(B)를 수확하기 전에 잎을 균질화(C)하기 전에 포함시켰다. (D) 조식물 추출물은 백 여과, 깊이 여과 및 0.2 μm 멸균 여과에 의해 정제되었다. (E) DFE는 IMAC에 의해 정제되었다. (F,G) 정제된 DFE 친화성 리간드는 EDC/NHS 활성화 가교 아가로즈 컬럼상에 고정화되었다. (H) T-DNA 인코딩 항체 2F5를 운반하는 세균 배양체는 식물론에서 자란 N. 벤타미아나 식물(I)에서 과도 발현을 위해 사용하였다. (J) 벤타미아나 잎을 D.(K) mAb 2F5에 기재된 바와 같이 수확 및 가공하여 DFE 친화성 컬럼(L)을 이용하여 정제된 추출물로부터 정제하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

1. 트랜스제닉 담배 식물 재배 참고: DFE 융합 단백질의 설계 및 형질전환 식물의생성은 다른 곳에서 5,17에기재되어 있다. 토양에서 형질전환 담배 묘목을 발아시. 1.0 g·으로 식물관개 L-1 비료 용액. 100mm x 100mm x 60mm(길이, 너비, 높이) 냄비에 식물을 옮겨 직경 ~0.04m로 자랍니다. 16-h 포토 기간 (25/22 °C 빛 / 어두운 온도 정권)으로 온실에서 트랜스 제닉 담배 식물을 경작하고 상대 습도 70 %와 1.0 g의 자동 수정으로 재배합니다. L-1 비료 용액은 시간당 15 분. 7 주 후, 식물 줄기의 기지에서 네 개의 자엽 잎을 제외한 모든 잎을 수확. 아래에 설명된 대로 수확한 잎을 즉시 처리합니다. 2. 숙주 세포 단백질의 열 침전 스테인리스 스틸 가열 용기(0.3m x 0.3m x 0.3m)에 20L 작동량의 수조를 설치합니다. 시작시, 5 L 분-1의흐름으로 액체를 영구적으로 교반하기 위해 수조에 자기 펌프를 놓습니다. 온도 제어를 위해 수조에 조절 식 온도 조절장치를 장착하십시오(2.4단계 및 2.8단계).주의 사항: 2.10까지의 모든 다음 단계는 뜨거운 액체의 처리를 포함한다. 열 절연 장갑과 고글을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 수조에 15L의 탈이온수를 넣고 액체를 70°C로 가열합니다. 마그네틱 교반기위에 탈이온수 5L로 채워진 10L 버킷을 놓습니다. 120 mM의 최종 농도에 인산나트륨을 추가합니다. 10 M 염산을 사용하여 pH를 8.14로 조정합니다. 모든 성분이 용해되면, 2.2 단계에서 수조에 생성된 농축 블랜싱 버퍼(5L)를 추가합니다. 온도가 70 °C에 도달 할 때까지 수조를 교반. 필요한 경우 10M 염산을 사용하여 pH를 8.14로 조정합니다. 필요한 온도와 pH에 도달한 후 최소 15분 동안 교반을 계속하여 전체 어셈블리가 열 평형 상태인지 확인합니다. ~17°C의 온도에서 탈이온수로 채워진 20L 버킷(0.3 m m x 0.3 m x 0.3 m)을 준비합니다(단계 2.9에 필요). 1.3단계에서 수확한 담배 잎 400 g을 준비합니다. 천공 바구니(0.2m x 0.2m x 0.2m, 공극 너비 0.02m x 0.02m)에 한 개의 알리쿼트를 놓습니다. 식물 재료로 바구니를 과도하게 채우거나 나뭇잎을 너무 단단히 포장하여 조직이 손상되지 않도록 하십시오. 2.4단계에서 바구니를 뜨거운 희게 하는 완충액에 완전히 담그고 모든 잎이 액체 표면 아래에 남아 있는지 확인합니다. 필요한 경우 열안정 실리콘 숟가락을 사용하여 잎을 표면 아래에 고정시고 있습니다. 펌프가 여전히 액체를 교반하는 동안 희석 유체에 1.5 분 동안 담배 잎을 배양. 전체 잠복기 동안 액체 온도를 모니터링합니다. 담배 잎으로 펌프 입구를 막지 마십시오. 희게 버퍼에서 담배 잎의 바구니를 제거하고 30 s에 대한 잎에서 잔류 버퍼를 배출. (단계 2.5에서) 차가운 물로 채워진 양동이에 바구니를 전송하고 30 s. 바구니를 제거하고 le에서 잔류 물을 배출 균질화 하기 전에 30 s에 대 한 aves (단계 3). 2.6에서 2.9단계까지 신선한 알리쿼트로 2.6단계를 반복하여 수확한 전체 바이오매스가 처리될 때까지 반복합니다. 지속적으로 모니터링하고 수조에서 희게 버퍼의 pH와 온도를 조정합니다.참고: 연한 식물 재료는 전체 바이오 매스를 처리하기 위해 여러 번의 희게 주기가 필요할 때 최대 30 분 동안 얼음에 보관 할 수 있습니다. 희게 된 잎은 최소 3주 동안 -80°C의 진공 밀봉 백에 보관할 수 있습니다. 그러나 장기간 저장소는 DFE 수율을 줄일 수 있으므로 즉각적인 처리가 권장됩니다. 3. 단백질 추출 및 설명 주의 사항: 다음 단계에는 회전 블레이드가 있는 블렌더가 포함됩니다. 모터 장치에 전원을 공급하거나 장착할 때 블렌더 용기에서 작동하지 마십시오. 블렌더 용기에 희미담배 잎 150 g(습식 질량)을 넣고 추출 완충액 450 mL(인산나트륨 50m, 염화나트륨 500m, 이설산나트륨 10m, pH 7.5)을 첨가한다. 블렌더 캡을 단단히 닫아 식물 재료 또는 완충제의 유출을 방지하십시오. 각 펄스 사이에 30 s의 휴식과 함께 30 s에 대한 3 x의 잎을 균질화하십시오. 모든 잎이 균질화되고 블렌더 용기의 상단에 달라붙지 않도록 하십시오. 필요한 경우, 휴식 중에 블렌더를 열고 깨끗한 실리콘 숟가락을 사용하여 용기의 상부에 붙어있는 잎을 밀어 내립니다. 균질화 후, 후속 분석을 위해 균질화의 1.0 mL 샘플을 취한다(단계 7). 적당한 크기의 용기에서 균질체를 수집합니다 (예 : 총 바이오 매스 1.0 kg로 작업하는 경우 용량이 5 L 이상인 용기를 사용하십시오). 모든 희게 된 바이오매스가 균질화될 때까지 3.1에서 3.3 단계를 반복합니다. 백 필터를 필터 마운트에 장착하고 적절한 크기의 다른 용기(3.4 참조)를 어셈블리 아래에 놓습니다. 백 필터에 ~0.15 L 분-1의속도로 균질체를 적용합니다. 후속 분석(단계 7)을 위해 각 리터 후 의 백 여과액샘플을 취하고, 탁도계 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 추출 완충액에서 1:10 희석으로 백 여과물 풀의 탁도를 측정한다. 또한 가방 여과풀의 리터당 K700(상단) 및 KS50(아래쪽) 깊이 필터 층 조합을 사용하여 0.02 m2의 백 여과물 풀을 명확히 한다. 0.2 MPa의 최대 압력까지 3.0 L min-1·m-m-2의 유량을 적용한다. 이어서 앞서 설명한바와같이 0.2 μm 멸균 필터를 통해 정제된 여과액을 통과시킴으로써 잔류 입자를 제거한다 5. 4. DFE 선호도 리간드의 정화 용출 완충제 (10 mM 인산나트륨, 300 mM imidazole, pH 7.4), 세척 버퍼 (10 mM 인산나트륨, pH 7.4) 및 평형 완충제 (20 mM 인산나트륨, 500 mM 염화 나트륨, 염화 나트륨 7.4)로 플러싱하여 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템을 준비합니다. 잎 바이오매스 킬로그램당 킬레이트 가교 아가로즈 수지 ~50 mL을 함유하는 컬럼을 장착한다(~2.5L 깊이의 여과). 200 mM 니켈 황산액의 5 개의 열 부피 (CV)를 적용하여 니켈 이온으로 컬럼을 충전하고 용출 버퍼 5 CV로 세척하십시오. 50cm h-1의 유량을 사용하고 이후의 모든 크로마토그래피 단계에 대해 260, 280 및 558 nm에서 UV 신호를 모니터링합니다. 10 CV의 평형 버퍼로 열을 평형화합니다. 그런 다음 정제된 식물 추출물(3.6단계)의 50 CV를 컨디셔닝된 컬럼에 로드합니다. 세척 버퍼 10 CV로 열을 씻으하십시오. DFE 융합 단백질을 5 CV 용출 완충액으로 용출하고 UV 신호가 280 nm 및 558 nm에서 증가하면 제품 함유 분획을 수집하여 기준선 보다 5 mAU 이상으로 증가시켰다. 총 수용성 단백질(TSP) 농도(단계 7.1), DFE 농도(단계 7.2 및 7.3), 및 DFE 순도(단계 7.4)를 측정하기 위해 용출 분획으로부터 0.2 mL 샘플을 채취한다. 크로마토그래피 시스템에 가교 덱스렌 수지 ~50 mL가 들어있는 컬럼을 장착합니다. 5 CV의 커플링 버퍼(200 mM HEPES, 500 mM 염화나트륨, pH 8.5)로 컬럼을 평형화합니다. 완충 교환을 위해 DFE 용출 분획(단계 4.4)의 10 mL을 주입하고 280 및 558 nm에서 UV 흡광도를 모니터링합니다. 280 nm 및 558 nm에서 UV 신호가 기준선 보다 5 mAU 이상으로 증가하면 DFE 함유 분획을 수집합니다. 0.2 mL 샘플을 취하고 TSP 농도, DFE 농도 및 DFE 순도를 결정합니다(단계 7). 정제된 DFE 샘플(4.7단계로부터)을 원심분리기에서 30분 동안 4°C에서 3,000 x g에서 원심농축기 튜브를 사용하여 15 g L-1로 농축한다. 커플링 반응(단계 5)을 계속합니다.참고: 농도 또는 커플링 단계를 즉시 수행할 수 없는 경우 DFE 용액을 4°C에서 보관하십시오. 5. 활성화 된 가교 아가로즈 수지에 DFE 커플링 참고: 결합을 위한 모든 장비와 솔루션이 준비될 때까지 NHS 활성화 열을 보관하는 데 사용되는 이소프로판올을 교체하지 마십시오. 열을 건조하게 하지 마십시오. pH, 완충조성 및 DFE 농도를 인자로 하여 활성화된 수지에 대한 DFE의 결합을 최적화하기 위한 실험(DoE) 모델의 설계를 설정한다. DoE 방법의 세부 사항은 다른곳에서 설명15. 0.5~15g의 농도 범위에서 친화성 리간드 용액(단계 4.8부터)을 준비합니다. L-1 또는 DoE에 정의된 바와 같이 커플링 반응이 준비될 때까지 얼음 위에 보관한다(단계 5.5). DFE 용액으로 최소 10개의 2mL 주사기를 채우고 1.0 mL의 침대 부피로 NHS 활성화 가교 아가로즈 컬럼에 주사기를 장착할 어댑터를 준비합니다. 커플링에 사용되는 10개의 컬럼마다 30mL의 비활성화 용액(0.5M 에탄놀라민, 0.5M 염화나트륨, pH 8.3), 저pH 용액 30mL(0.1M 아세테이트 나트륨, 염화나트륨, pH 4.0) 및 저장 용액 10mL(0.0m , 0.1% (m/v) 나트륨 아지드, pH 7.0.0. 튜브에 1 mM 염산의 20 mL를 준비하고 적어도 20 분 동안 얼음에 배양. 결합 반응 동안 모든 단계에 대한 유동 분획을 모니터링하는 정밀 스케일을 준비 (단계 5.7). 밀봉된 NHS 활성화 가교 아가로즈 컬럼을 열고 컬럼 입구에 주사기 어댑터를 장착합니다. 주사기에 연결하기 전에 어댑터 입구에 버퍼 방울을 적용하여 컬럼에 공기가 유입되는 것을 방지합니다. 6 mL의 얼음 차가운 1 mM 염산 (단계 5.4에서)으로 컬럼을 1 mL 분-1의 유량으로 세척하고 즉시 5.7 단계로 진행하십시오. 1.5 mL의 DFE 용액(단계 5.2)을 2 mL 주사기를 사용하여 <1 mL min-1의 유량으로 주입하고 후속 분석(단계 7)을 위해 정밀도(단계 5.4)에서 유동 분획을 수집합니다. DoE 설정에 따라 컬럼을 양단에 밀봉하고 22°C에서 15-45분 동안 배양합니다. 6 mL의 비활성화 용액을 주입하고 6 mL의 저pH 용액을 수지로부터 비공유 결합 리간드를 제거하기 위해 <1 mLmin-1의 유량으로 사용한다. 그런 다음 6 mL의 비활성화 용액을 주입하고 15 분 동안 컬럼을 배양하십시오. 저pH 용액 6mL를 컬럼에 주입한 다음 6 mL의 비활성화 용액을 주입합니다. 그런 다음 저pH 용액의 또 다른 6 mL를 컬럼에 주입합니다. 2 mL의 저장 용액을 컬럼에 주입하고 4 °C에서 보관하십시오. 6. 정제 된 식물 추출물에서 mAbs의 정제 테스트 2F55 또는 상층부 함유 2F5를 함유하는 정제식물 추출물의 100 mL을 준비시키고, 또한 2F5를 함유한다. 평형 완충제 준비 (20 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.4), 저pH 용출 완충제 (0.05 M 구연산염, 0.05 M 염화나트륨, pH 4.0-3.25), 고이온 강도 용출 완충제 (1.0-4.0 M 염화 마그네슘, 0.1 M HEPES, pH 8.0) 크로마토그래피 시스템을 버퍼로 플러시합니다. 크로마토그래피 시스템에 DFE 선호도 컬럼(단계 5.10)을 장착하고 1.0 mL min-1의 유량으로 5 CV의평형 버퍼와 평형을 지정합니다. 280 nm에서 UV 흡광도를 모니터링합니다.참고: 식물 추출물 또는 세포 배양을 기둥에 상류로 적재하면 배압이 증가할 수 있습니다. 크로마토그래피 시스템 또는 DFE 컬럼의 손상을 방지하기 위해 0.2 MPa에서 고압 경보를 설정합니다. 정제된 식물 추출물 또는 상층부(단계 6.1)의 80 mL을 0.5 mL의 유량으로 컬럼상에 하중하여 2분의 접촉 시간을 보장한다. 즉각적인 시료 분석이 불가능한 경우 유동 관통 시료를 4°C에서 보관하십시오. 6 CV의 평형 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 이 단계의 시작, 중간 및 끝에 세척 샘플을 수집합니다. 저pH 용출 완충제 또는 고이온 강도 용출 완충제(0.1 M HEPES, 염화 마그네슘 1.25M, pH 8.0)의 5 CV를 함유한 elute mAb 2F5. UV 280 nm 신호가 기준선 보다 5 mAU로 증가했을 때 DFE 분율을 수집합니다. 각 에피토프-항체 쌍에 대한 용출 완충제를 최적화한다. 2F5의 경우, 1.25M 염화마그네슘은 제품 회수와 리간드 안정성 사이의 최적의 균형을 이루었습니다.참고: 염화마그네슘 용액은 침전되기 쉽습니다. 따라서 염화 마그네슘을 ~ 700 mL의 물에 용해시. HEPES를 100 mL의 물에 별도로 용해시키고 pH를 8.0으로 조정합니다. 용존 염화마그네슘 용액을 HEPES 용액에 추가하고 최종 부피 1.0L에 물을 추가합니다. 침전을 일으키기 때문에 염화마그네슘을 용해한 후 pH를 조절하지 마십시오. 브래드포드 방법, 리튬 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (LDS-PAGE) 및 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분광학 (단계 7)을 사용하여 6.4-6.6 단계 동안 취한 모든 샘플을 분석한다. 7. 샘플 분석 브래드포드 방법 18,19를사용하여 TSP 농도를 측정합니다. 삼중, 각 샘플의 파이펫 2.5 μL을 96 웰 플레이트의 단일 웰로. 0-2,000 mg의 범위를 커버하는 삼중항에 8개의 소 혈청 알부민(BSA) 표준을 사용하십시오. L-1. 200 μL의 브래드포드 시약을 각 웰에 넣고 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 섞으세요. 파이펫 레벨을 유지하여 후속 판독을 왜곡하는 기포형성을 방지합니다. 22 °C에서 10 분 동안 플레이트를 배양하고 분광 광도계에서 595 nm에서 흡광도를 측정합니다. BSA 기준점을 통해 표준 곡선을 기준으로 샘플의 TSP 농도를 계산합니다. 형광량에 의한 DFE 정량화 삼중, 각 샘플의 파이펫 50 μL은 검은 색 96 웰 반 영역 플레이트의 단일 웰로. 0-225 mg· 범위를 포괄하는 6개의 DsRed 표준을 포함합니다. L-1. 분광광도계에서 530±30 nm 여기 필터 및 590±35 nm 방출 필터를 사용하여 형광을 2회 측정하였다. DsRed 기준점을 통해 표준 곡선을 기준으로 샘플의 DFE 농도를 계산합니다. SPR 분광법20으로2F5 농도를 측정합니다. HBS-EP 러닝 버퍼(10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-피페라진에탄설포닉산(HEPES), 3 mM에티에티아미네테트라아세트산(EDTA), 염화나트륨 150m, 0.005% v/v Tween-20, pH 7.4) 및 0.2 μm 진공을 통과하여 필터 멸균 병 상단 필터. 버퍼를 15분 동안 탈기합니다. 카복시메틸화 된 덱스트란 표면 칩을 도킹하기 전에 HBS-EP 실행 버퍼를 SPR 계측기에 연결하고 주요 기능을 사용하여 시스템을 평형화하십시오. 30 μL min -1의 유량으로 수동 실행을 시작하고 30 μL min-1의 유량 속도로 유량 세포 1 및 2에 30 mM 염산 및 25 mM 수산화 나트륨 (각각 2 회 주사)을 교대로 주입하여 칩 표면을 1 분 동안 30 μL 분-1로 조절하십시오. 500 mg의 300 μL을 준비합니다. L-1 단백질 아세테이트 나트륨 10 mM (pH 4.0)에서 용액. 0.4 M 1-에틸아미노프로필(3-디메틸아미노프로필) 카르보디미드 염산염(EDC) 및 0.1 M NHS 및 원심분리기를 1분 동안 16,000 x g에서 함유한 해동 바이알은 EDC 70 μL과 NHS 의 70 μL을 혼합한다. EDC/NHS 혼합물과 단백질 A 용액을 7mm 플라스틱 시료 바이알에 옮기고 샘플 랙에 놓습니다. 10 μL 분-1의 유량으로 흐름 세포 1 및 2에 EDC/NHS 혼합물을 10분 동안 주입하여 카복시메틸화된 덱스터형 덱스터형 덱스터니 칩 표면을 활성화합니다. 단백질 A를 활성화된 카르복시메틸화 덱젠 표면에 15 μL 분-1의 유량으로 유량 2이상 단백질 A 용액을 주입하여 15분 동안. 단백질 A를 결합하는 동안, 1.0 M 에탄올라민 염산염(pH 8.5)의 바이알을 1분 동안 16,000 x g에서 해동합니다. 7.3.5단계가 완료되면, 7분 동안 10 μL분-1의 유량으로 유량 세포 1 및 2에 에탄올라민 용액을 주입하여 칩 표면을 비활성화한다. 0.5분 동안 30 μL min-1의 유량으로 유량 세포 1과 2에 걸쳐 30 mM 염산과 25 mM 수산화 나트륨 (각각 2 회 주사)을 교대로 주입하여 칩 표면을 컨디셔닝합니다. 500 μg의 농도에서 HBS-EP 실행 버퍼에서 항체 2F5의 표준을 준비합니다. L-1 및 HBS-EP에서 2F5를 함유하는 샘플을 20-1,000 μg 범위의 최종 농도로 희석합니다. L-1. 30 μL min-1의 유량으로 유량 세포 1과 2에 샘플 및 표준을 3 분 동안 주입합니다. 각 시료에 대한 유동셀 2(측정 셀)의 신호로부터 유동셀 1(기준 셀)의 상대 단위(RU) 신호를 빼고 2F5 표준 주사의 RU 신호에 기초하여 항체 농도를 계산한다. 모든 시료 또는 표준 주입 후, 30 μL min-1의 유량속도로 30 mM의 염산을 주입하여 칩 표면을 0.5 분 동안 유동 세포 1 및 2를 재생합니다. 2F5 획기적인 곡선을 얻기 위해 부피를 통해 흐름을 통해 흐름에 대해 단계 6.4에서 각 유량 샘플에 대한 2F5 농도를 플로팅합니다. 로딩 2F5 농도의 10%에 도달했을 때 주입된 2F5의 양을 계산하여 10% 동적 결합 용량(DBC)을 얻었다. LDS-PAGE로 단백질 샘플을 분석합니다. 즉시 사용할 수 있는 4-12% BisTris LDS 폴리아크릴아미드 젤을 열고 전기 영동 모듈에 놓습니다. 800 mL의 러닝 버퍼(50mM MES, 50mM Tris 베이스, 0.1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7.3)을 모듈에 전송하고 0.5 mL의 항산화 솔루션을 추가합니다. 1.5 mL 반응 튜브에서 로딩 버퍼 10 μL을 환원제 4 μL 및 단백질 샘플의 26 μL과 혼합합니다. 80 °C에서 10 분 동안 열 블록에 튜브를 배양. 30 s에 대 한 500 x g에서 튜브를 원심 분리기. LDS 폴리아크릴아미드 겔(차선당 시료 10μL)을 적재하고 미리 염색된 단백질 표준(10-180 kDa)의 5 μL을 별도의 차선에 적재합니다. 전기 동공 챔버를 닫고 전원 공급 장치를 연결합니다. 전기 동공은 40 분 동안 일정한 200 V에서 실행해야합니다. 전기 동공 챔버에서 겔을 제거합니다. 젤 을 열고 19 rpm에 셰이커에 물에 15 분 동안 젤을 씻어. 19 rpm에서 셰이커에 염색 용액에 1 시간 동안 젤을 염색하십시오. 19 rpm에서 셰이커에 물에 1 시간 동안 젤을 스테인. 필름 스캐너를 사용하여 젤을 스캔합니다.

Representative Results

친화성 리간드의 발현 및 정제 융합 단백질 DFE는 온실에서 자란 형질전환 담배 식물에서 발현되었다. 수율은 ~ 120 mg/kg-1 잎 질량이었고 식물당 평균 바이오매스는 ~130 g이었다. DFE 순도는 희게하기 전에 조식물 추출물에서 TSP의 97%를 침전시켰다. 희게 하는 단계는 수확 및 추출 루틴에용이하게 통합되었고(도 1) 수조 설치를 포함하여 2시간 미만의 추가 시간이 걸렸습니다. DFE의 전반적인 회복은 23.5 mg kg1의 순도 >90%였다. 제품 손실을 담당하는 단계는 희게, 깊이 여과 및 IMAC였으며, 각각 40%, 27%, 45%의 특정 손실이 있었습니다. 깊이 필터 용량은 평균 135±36 Lm-2(±SD, n=3)였고, 따라서 문헌21에보고된 값의 상부 범위였다. DFE 수율은 식물 시대에따라 증가했습니다(그림 2). NHS 활성화 크로마토그래피 컬럼에서 친화성 리간드의 고정화 초기 커플링 테스트 동안 HEPES 버퍼(pH 8.3)는 제조업체가 권장하는 중탄산염 완충제에 대해 78±9%(±SD, n=3)에 비해 결합 효율을 89±6%(±SD, n=3)로 증가시켰습니다. 따라서, HEPES는 모든 후속 커플링 실험에 사용되었다. DFE와 NHS 활성화 가교 아가로즈 수지의 결합 효율을 최적화하기 위한 DoE 접근법이 선택되었다. 수지에 고정화된 DFE의 절대량은 기둥에 주입되고 ~15 g에서 고원화된 DFE의 질량으로 증가한다· L-1은 커플링 수율이 더 많은 DFE가 주입됨에 따라 지속적으로 감소한 반면(도 2). 결합 수율은 또한 산성 완충액에서 >50% 더 낮았으며, 이는 사례별로 각 리간드에 적합한 결합 조건을 스크리닝할 필요성을 나타낸다. 결합 수율, 고정화 DFE 및 컬럼 비용의 절대 수량측면에서 이상적인 조건은 DoE 소프트웨어의 수치 최적화 도구를 사용하여 확인되었습니다. 가장 바람직한 조건(가교 아가로즈 수지의 1 mL당 DFE 의 pH 9.0 및 7.0 mg)은 큰 고원에 위치하여 견고하였다. DFE 분자는 커플링 후에도 적색 형광을 유지하고, 색 강도는 고정화 DFE의 총량에 해당하였다(도 2). 따라서 컬럼 색상은 커플링 효율 및 컬럼 품질을 추정하기 위한 간단한 품질 관리 매개 변수로 사용될 수 있습니다. 형광은 또한 DFE 융합 단백질이 네이티브 DsRed의 테트라메릭 상태에서 조립됨을 확인하. 도 2: NHS 활성화 가교 아가로즈 수지에 대한 DFE 고정화의 최적화. (A) LDS-PAA 젤은 불미스러운 형질전환 DFE 식물 추출물로부터 의 균질및 용출 샘플의 웨스턴 블롯 오버레이를 함유한다. 식물의 수확은 시종 후 38, 45 또는 52일 후에 수행되었다. 서양 얼룩은 항-그의 6-항체5를사용하여 수행되었다. (B) NHS 활성화 가교 아가로즈 컬럼에 주입된 정제된 DFE의 pH 및 전체 질량을 결합하는 경우 의존성에서 결합된 DFE 친화도 리간드의 총량. 빨간색 점은 응답 표면 모델을 작성하기 위해 수행된 실제 실험을 나타냅니다. (C) 커플링 절차 후 DFE 선호도 컬럼. 숫자는 패널 B. dps = 일 사후 시드에 강조 표시된 커플링 조건에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. DFE 선호도 수지사용 2F5 절연 테스트 재조합 2F5 항체는 식물론5에서 자란 니코티아나 벤타미아나 식물에서일시적으로 생산되었다. 조식물 추출물로부터 2F5의 포획을 ~7.0 mg 정제된 DFE와 결합된 친화성 컬럼을 사용하여 시험하였다(단계 6). 단백질 A 수지로부터의 용출은 일반적으로 산성 완충제(pH~3.3)(13)를 수반한다. 따라서, 우리는 처음에 DFE 컬럼에 대해 상이한 저pH 용출 버퍼(pH 0-3.25)를 평가하였다. 2F5의 용출은 pH 3.25에서 ~35%의 가장 높은 회수와 함께 4.5 이하의 pH 값에서 성공적이었다. 그러나, 저-pH 용출은 항체(SPR 분광법에 의해 확인된 바와 같이)와 DFE 리간드(색의 손실 및 하부 DBC, 도3)를 불활성화하였다. 후자는 pH & lt;4.022,23에서네이티브 DsRed 변성 주어진 예상되었다 . 제품 및 리간드 변성을 피하기 위해, 우리는 이전에 다른 친화도 수지(24)로부터mAbs를 용출하는 데 사용되었기 때문에 대체 용출제로 염화 마그네슘을 테스트했습니다. 염화마그네슘 농도가 1.25 M인 마그네슘 농도는 105±11% (±SD, n=3) 및 97±3%의 순도(±SD, n=3)의 회수와 함께 DFE 친화성 수지로부터 2F5를 용해시키기에 충분하였다. 이 성능은 단백질 A 수지25,26과비교되었다. DFE-정제된 2F5 항체와합성 리간드 푸제온의 평형 해리 상수(KD)는 791 pM이었던 반면, 단백질 A-정제 대응물의 경우 는 763 pM5였다. 더욱이, 총 25번의 바인드 및 용적 사이클에 걸쳐 수지에서 실질적인 색 손실이 관찰되지 않았다. DFE 친화성 수지의 DBC는 10% 2F5의 돌파구로 25사이클동안 선형적으로 감소하여 초기값의 ~15%로 떨어졌다(도 3). 그림 3: DFE 친화성 수지를 사용하여 정제된 식물 추출물로부터 2F5의 절연을 테스트합니다. (a) DFE 친화성 수지 는 pH 6.0에서 중화 단계 후 4.0-3.0 범위및 동일한 수지에서 상이한 pH 값을 가진 버퍼를 사용하여 1회 용출 사이클 후 수지. (B) DFE 친화성 수지 1 및 6 사이클 후 2F5 정제 1.25 M 또는 4.00 M 염화 마그네슘을 용리제로 사용한다. (C) 염화마그네슘을 용리물로 사용하여 DFE 수지의 주기 의존적 동적 결합 용량을 결정하기 위한 전두엽 하중 실험(브레이크스루 곡선)의 크로마토그램. 브레이크스루 곡선은 4.0 M 및 1.25 M 염화마그네슘 용출 완충제 및 다양한 사이클 번호로 측정되었다. (D) 염화마그네슘을 용리물로 사용하는 DFE의 주기 의존적 동적 결합 용량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

새로운 친화성 수지의 적용

우리는 mAb의 포획을 위한 사용자 정의 친화성 크로마토그래피 수지가 NHS 활성화된 가교 아가로즈에 mAb 특이적 에피토프를 포함하는 리간드를 고정시킴으로써 제조될 수 있음을 보여주었다. 이러한 수지를 설계하기 위해서는 에피토프 서열을 알고 선형 에피토프를 사용해야 했습니다. 생성된 수지는 잠재적으로 고가의 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계를 대체할 수 있기 때문에 mAbs의 포획에 유리하다. 우리의 사례 연구에서 2F5와 DFE 사이의 상호 작용은 에피토프-파라토프 결합에 의해 매개되었기 때문에, 우리의 리간드는 대부분의 뮤린과 인간 IgGs의 Fc 영역에 결합하는 단백질 A보다 더 선택적이어야 합니다. 개별 리간드가 각 mAb에 필요하기 때문에, 우리의 방법은 처음에 아주 큰 규모로 생성되는 항체를 위해 주로 적당한 것처럼 보일 수 있습니다. 그러나, 우리의 접근법과 신속한 식물 기반 과도 단백질 발현을 결합함으로써, 새로운 친화도 리간드를 최소한의 노력으로^27주 이내에 제조할 수 있다^28. 따라서, 이 방법은 또한 소규모 mAb 정제에 적합하다.

선호도 리간드의 생산 및 잠재적 개선

식물은 우리의 사례 연구에 등장하는 DFE 융합단백질과 같은 친화 리간드 5,^29,^30에대한 빠르고 안전한 생산 플랫폼을 제공합니다. 식물 재료를 희게하는 것은 한 단계로 숙주 세포 단백질의 양을 크게 감소시키고 표준 설명 루틴에 쉽게 통합되었습니다. 그러나, 리간드의 회수는 다른^제품(31,^32,^33)에대해 보고된 바와 같이, 필터 층에 대한 적당한 열 안정성 및 일부 비특이적 결합으로 인해 현재 설정에서 낮았다. 열 안정성을 높이기 위해 담체를 엔지니어링하는 것은 말라리아 백신 후보CCT, 항종양 효소 PpADI 또는 중증 β-글루코시다아제(34)에 대해 설명한 바와 같이 향후 리간드 수율을 개선하는 데 도움이 될 수^있다. ³⁵^,³⁶. 단백질 공학이 필터 물질(37)에 대한 비특이적 결합을 감소시키는 데도움이 될 수 있는 깊이 여과 단계에 대해도 마찬가지입니다. DFE 및 유사한 리간드에 대한 생산 비용은 또한 응집제 또는 필터 첨가제를 사용하여 해명의 전반적인 효율을 향상시킴으로써 감소될 수 있었다^38,^39.

DsRed가 캐리어로 사용될 때, 그것은 테트라메릭 복합체를 형성한다. 이는 리간드당 에피토프의 수를 증가시키기 때문에 유리하지만, 또한 친화성 크로마토그래피 동안 분해 또는 변성에 더 취약한 리간드를 렌더링할 수 있다. mCherry와 같은 단모성 담체 단백질은 따라서 낮은 pH^40에서안정하기 때문에 바람직할 수 있으며, 에피토프의 탠덤 반복을 포함하면 리간드의 열이도가 증가하고 따라서 수지 용량5를 증가시킬 수^{있습니다.} ^26세 ^, ⁴¹. 간단한 담체 에피토프 단백질 (즉, 이황화 결합 또는 번역 후 변형이없는 단백질)의 경우 미생물 생산 시스템은 제조 비용을 줄이고 단백질 A와 리간드를 더 경쟁력있게 만들 수 있습니다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질은 ~1 g/kg-1 바이오매스의 수율을 가진 세균 세포에서 발현되어 왔으며, 이는 리간드 생산 비용^42를현저히 감소시킬 것이다.

발현 숙성에 관계없이, 수지 선택성 및 용량을 감소시킬 수 있는 숙주 세포 단백질 또는 매질 성분의 고정을 최소화하기 위해 커플링 동안 정제된 친화도 리간드가 요구되었다. IMAC 정제를 위한 폴리 히스티딘 태그의 포함은 순도를 한 단계에서 ~90%로 증가시키고, 신속하고저렴한 리간드 생산을 용이하게 하고,^43,^44. 그러나, 융합 태그의 위치는 에피토프 결합을 약체적으로 방해하거나 담체(45,^46)로부터태그 또는 에피토프의 절단을 유도할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 중요하다.

NHS 활성화 크로마토그래피 컬럼에서 친화성 리간드의 고정화

고정화는 수동으로 또는 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행되었다. 열당 버퍼 볼륨이 작아서 수동 처리(예: 최소 폐기물 볼륨으로 인해)가 선호되는 것처럼 보였습니다. 그러나 여러 개의 더 큰 컬럼이 필요한 경우 크로마토그래피 시스템은 커플링 조건을 보다 쉽게 제어할 수 있게 하고(예: 규제 된 유량) DBC 측면에서 재현 가능한 결과를 얻을 가능성이 높습니다. 우리의 데이터는 결합 버퍼와 pH가 결합 효율성과 전체 컬럼 비용에 중요한 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 결합 반응에 영향을 미치는 스크리닝 인자와 각 담체 단백질(또는 각 담체-리간드 융합)에 대해 조정하면 결합 효율 및 수지 성능이 향상될 수 있으며 이 접근법을 권장합니다.

DFE 선호도 수지사용 2F5 절연 테스트

제품 수율 과 순도는 수지 성능의 중요한 측면이며, DFE의 경우 우리는 105 ± 11 % (±SD, n = 3)의 수율과 97 ± 3 % (±SD, n = 3)의 순도를 달성했으며, 이는 벤치 마크 단백질 A 수지^25의 ^{성능과 비교할 수 있습니다. ,}²⁶. 일반적으로 수지의 또 다른 핵심 성능 지표 (특히 선호도 리간드를 기반으로하는 경우)는 이 매개 변수가 특정 공정에 필요한 수지의 양과 따라서 비용에 영향을 미치기 때문에 10 % 제품 혁신에서 DBC입니다. DFE 리간드의 경우, 초기 DBC는 ~4 g·이었다. ^L-1 수지는 유사한 조건하에서 단백질 A에 대한 해당 값의 ~13%(접촉 시간 2분)인^25,^{47, 또는} 다른 맞춤형 선호도 수지에 비해 약 15배 더 높다. 반대로 FSH-면역affinity 리간드 2 분^48의동일한 체류 시간을 사용하여. DFE의 DBC는 25번의 바인드 및 용질 주기 후에 시작 값의 15%로 감소하였고, 반면 상업적 단백질 A 수지^49에서동일한 DBC 손실에 대해 50사이클 이상이 요구된다. 그러나, 우리의 운반체는 아직 포괄적인 조사하고 지난 4 년간 8에 걸쳐 향상된 단백질 A와 같은정도로 최적화되지 않았다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.

지금까지 우리는 이전 연구^13에서권장하는 바와 같이 저pH 용출 완충제에서 고농도의 염화마그네슘으로 전환함으로써 수지 안정성 및 제품 회수를 향상시켜 있다(도 3). 친화성 리간드의 특징적인 적색은 25번의 바인드 앤 드 루트 사이클 동안 실질적으로 퇴색하지 않았기 때문에, 우리는 정제된 식물 추출물(31)에서 내인성 식물 프로테아제(31)가 잘리되어 에피토프를 불활성화시킬 수 있다고 추측한다. 리간드. 따라서 캐리어와 에피토프를 연결하는 프로테아제 내성 링커를 설계하면 연장된 수의 사이클에 걸쳐 초기 DBC를 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. DFE 리간드의 신속하고 간단한 발현 및 정제, 상업용 크로마토그래피 수지에 대한 간단한 결합, 우수한 제품 수율 및 순도를 감안할 때, 우리는 우리의 방법이 단백질 A에 적합한 대안을 제공한다고 믿습니다. 단백질 A에 결합하지 않는 mAbs 및 항체 유도체의 정제, 특히 담체 및 링커의 개선이 DBC 및 리간드 안정성을 향상시킬 수 있는 경우. 이러한 가정은 DFE-정제 및 단백질 A-정제 2F5 항체 5의 해리 상수의작은 차이에 의해 뒷받침되었으며, 이는 우리의 새로운 친화도 리간드가 고품질 mAbs의 회복을 허용함을 나타낸다.

방법의 이점 및 현재 제한 사항

반송파 단백질과 의 유전 적 융합으로 친화성 리간드를 제조하는 것은 수성 완충제에서 용해도를 증가시키고 따라서 전형적인 리간드 커플링 조건과의 호환성을 증가시킨다. 대조적으로, 고체 상 펩티드 합성으로부터 유래된 빈 펩타이드는 그들의 서열(50)으로 인해 이러한 조건 하에서 제한된 용해도를 가질 수 있으며, 이는 mAb에 의해 인식된 에피토프의 아미노산 서열에 의해 결정되기 때문에 변경될 수 없다. 정제될 수 있습니다. 그 외는 그러므로 펩티드 리간드(51)의 온-수지 합성을 사용하였다. 생성된 수지의 정적 결합 용량이 높았습니다(~80g· ^L-1)수지 제제의 과정은 길고, 동적 결합 용량은 보고되지 않았고, 얻어진 순도 및 회복은 우리의 접근법보다 낮았다. 실험실 규모에서 융합 단백질 리간드의 또 다른 장점은 리간드 및 이의 변이체가 사용하기 쉬운 고-경발^{시스템에서}최소한의 노력으로 빠르게 생산, 정제 및 테스트될 수 있다는 것이다.

여기에 제시된 방법의 두 가지 현재 제한사항은 3g·의 낮은 동적 결합 용량이다. ^L-1 및 25 바인드 및 용출 주기 의 과정을 통해 90 % 감소⁵. 이러한 제한 사항은 보다 엄격한 적재 조건을 적용하고 현재 DsRed 캐리어를 각각 보다 안정적인 엔지니어링 변형으로 대체하여 향후 해결될 수 있습니다. 예를 들어, 현재 접촉 시간을 2~4분으로 두 배로 늘리면 일부 단백질 A 수지(26)에 대해 도시된 바와 같이 동적 결합 용량을 두 배로 늘릴 수 있다.

문제 해결

다음 표에서는 이 프로토콜 중에 발생할 수 있는 잠재적인 문제를 중시하고 이를 해결하는 방법에 대한 힌트를 제공합니다(표 1).

표 1: 발생할 수 있는 잠재적인 문제 및 가능한 수정.
프로토콜 단계	문제	Couse	수정
1	식물은 성장하지 않습니다	손상된 성장 조건	비료의 pH 및 전도도 를 확인
			온도 및 조명 조건 확인
2 및 3	추출 후 대량의 숙주 세포 단백질이 존재합니다.	불완전한 강수량	희게하는 동안 온도 를 확인
			희게 목욕의 동요를 확인
2 및 3	식물 추출물에서 발견된 제품이 없습니다.	온도가 너무 높음	희게하는 동안 온도와 pH를 확인
		희게 버퍼의 pH가 너무 낮음
3	추출 후 큰 줄기 또는 잎 부품이 남아 있습니다.	블렌더의 불완전한 혼합	식물 재료가 블렌더에 플러그를 형성하지 않는지 확인하십시오.
3	깊이 여과 중 빠른 압력 증가	잘못된 필터 선택 및/또는 방향	필터 유형 및 방향 확인
4	용출 시 약간의 융합 단백질/많은 융합 단백질이 유입	IMAC 수지는 금속 이온으로 충전되지 않았습니다.	IMAC 수지가 이온으로 올바르게 충전되었는지 확인합니다.
		융합 단백질은 친화성 태그를 분실	식물 재배 중 강렬한 햇빛과 고온을 피하십시오.
4	농축 중 손실된 융합 단백질	막에 결합된 융합 단백질	멤브레인 유형 확인
			농도 계수가 너무 높지 않은지 확인하십시오.
5	낮은 커플링 수율	결합 시약 추가의 잘못된 시퀀스	시약 라벨 및 추가 순서 확인
		커플링 전에 열의 잘못된 준비	열 예비의 조건을 확인
5 및 6	낮은 mAb 수율	식물 바이오매스에서 의 낮은 mAb 발현	바이오매스의 mAb 발현 테스트
		낮은 리간드 밀도	융합 단백질 제제의 순도 확인
7	브래드포드 분석에서 매우 낮은 /고단백 농도	파이펫팅 중 기포 형성	96 웰 팔레트에서 거품 확인
7	SPR 측정 중 낮은 mAb 농도	손상된 단백질 A 칩	표준 mAb의 결과와 알려진 농도 비교
		잘못된 시료 희석	희석 속도 및 버퍼 확인

표 1: 트러블 슈팅.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 담배 발현 벡터를 제공하기 위한 형질전환 담배 식물과 토마스 라데마허 박사를 재배한 이브라힘 알 아메디(Ibrahim Al Amedi)에게 인정하고 싶습니다. 저자는 DFE 친화성 리간드 구조에 대한 유익한 토론에 대한 편집 지원과 마르쿠스 색 박사에게 감사하고 자합니다. 이 작품은 그랜트 번호에서 프라운 호퍼 – Gesellschaft 내부 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다. 125-600164를 유치하고 Leistungszentrum 부여 번호 423 “네트워크, 적응 생산”에서 노스 라인 – 웨스트 팔리아의 상태를 유치 할 수 있습니다. 이 작품은 연구 교육 그룹 “종양 표적 약물 전달”교부금 331065168의 프레임 워크에서 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 지원되었다. GE 헬스케어는 이 문서의 오픈 액세스 출판을 지원했습니다.

Materials

10L/20L Bucket	n/a	n/a	Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
ÄKTApure	GE Helthcare	29018226	Chromatography system
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	Centrifuge
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Antibody 2G12	Fraunhofer IME	n/a	Standard for SPR quantification
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Fuhr	2632410001	Bag filter
CanoScan 5600F	Canon	2925B009	Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chelating Sepharose FF	GE Helthcare	17-0575-01	Chromatography resin
Cond 3320	WTW	EKA 3338	Conductometer
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n/a	DoE software
Discovery Compfort	Gilson	F81029	Multichannel pipette
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Diverse bottles	Schott Duran	n/a	Glas bottles
Dri Block DB8	Techne	Z381373	Heat block
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	Buffer component
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	Plate reader
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	Thermometer
F9-C	GE Helthcare	29027743	Fraction collector
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200	Hettich	2400	Centrifuge
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	Chromatography columns
Hydrochloric acid	Carl Roth GmbH	4625.1	Buffer component
Imidazole	Carl Roth GmbH	3899.2	Buffer component
K700	Pall	5302305	Depth filter layer
KM02 basic	IKA	n/a	Magnetic stirrer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Immersion circulator
Magnesium chloride	Carl Roth GmbH	KK36.2	Buffer component
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm	Sartorius	16534K	Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter	Thermo Fischer Scientific	595-4520	Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate	Carl Roth GmbH	T111.1	Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer	Invitrogen	NP0002	Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant	Invitrogen	NP0005	Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa)	Invitrogen	26616	Protein standart
Perforated bucked	n/a	n/a	Blanching
PH 3110	WTW	2AA110	PH meter
PowerPac HC	Biorad	1645052	Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	P7837-5MG	Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran	GE Helthcare	17003301	Chromatography resin
Silicone spoon	n/a	n/a	Spoon
Simply Blue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Gel staining solution
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	6773.1	Buffer component
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	X891.1	Media component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-100G	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Buffer component
Sodium citrate	Carl Roth GmbH	HN13.2	Buffer component
Sodium bisulfite	Carl Roth GmbH	243973-100G	Media component
Sodium phosophate	Carl Roth GmbH	T877.2	Media component
SPR Affinity Sensor – High Capacity Amine	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	SPR-AS-HCA	SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	n/a	SPR device
SSM3	Stuart	10034264	Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L	Clatronic	n/a	Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL	B. Braun	4606027V	Syringes
Syringe adpter (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	Syringe adapter
TE6101	Sartorius	TE6101	Precision scale
Tween-20 (Polysorbate)	Merck	8170721000	Buffer component
Unicorn 6.4	GE Helthcare	29056102	Chromatography software
Vacuum bags	Ikea	203.392.84	Plant storge
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Vortex
XK-26/20 column housing	GE Helthcare	28-9889-48	Chromtography column

Referências

Kesik-Brodacka, M. Progress in biopharmaceutical development. Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (3), 306-322 (2018).
Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
Jayapal, K., Wlaschin, K. F., Hu, W. S., Yap, M. G. S. Recombinant Protein Therapeutics from CHO Cells – 20 Years and Counting. Chemical Engineering Progress. 103, 40-47 (2007).
Kunert, R., Reinhart, D. Advances in recombinant antibody manufacturing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (8), 3451-3461 (2016).
Rühl, C., Knödler, M., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. A linear epitope coupled to DsRed provides an affinity ligand for the capture of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1571, 55-64 (2018).
Edgue, G., Twyman, R. M., Beiss, V., Fischer, R., Sack, M. Antibodies from plants for bionanomaterials. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1462 (2017).
Buyel, J. F., Fischer, R. Very-large-scale production of antibodies in plants: The biologization of manufacturing. Biotechnology Advances. 35 (4), 458-465 (2017).
Bolton, G. R., Mehta, K. K. The role of more than 40 years of improvement in protein A chromatography in the growth of the therapeutic antibody industry. Biotechnology Progress. 32 (5), 1193-1202 (2016).
Kelley, B. Industrialization of mAb production technology: the bioprocessing industry at a crossroads. MAbs. 1 (5), 443-452 (2009).
Brochier, V., Ravault, V. High throughput development of a non protein A monoclonal antibody purification process using mini-columns and bio-layer interferometry. Engineering in Life Sciences. 16 (2), 152-159 (2016).
Arakawa, T., Futatsumori-Sugai, M., Tsumoto, K., Kita, Y., Sato, H., Ejima, D. MEP HyperCel chromatography II: binding, washing and elution. Protein Expression and Purification. 71 (2), 168-173 (2010).
Barroso, T. B., Aguiar-Ricardo, R. J., Roque, A. C. Structural evaluation of an alternative Protein A biomimetic ligand for antibody purification. Journal of Computer-aided Molecular Design. 28 (1), 25-34 (2014).
Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O’Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography A. 1415, 83-90 (2015).
Sack, M., et al. Functional analysis of the broadly neutralizing human anti-HIV-1 antibody 2F5 produced in transgenic BY-2 suspension cultures. FASEB Journal. 21 (8), 1655-1664 (2007).
Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study. Journal of Visualized Experiments. (83), 51216 (2014).
Trasatti, J. P., Woo, J., Ladiwala, A., Cramer, S., Karande, P. Rational design of peptide affinity ligands for the purification of therapeutic enzymes. Biotechnology Progress. 34 (4), 987-998 (2018).
Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochemical Engineering Journal. 88, 162-170 (2014).
Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Current Protocols in Molecular Biology. 76 (Chapter 10), (2006).
Buyel, F. J., Kaever, T., Buyel, J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5’UTR combination. Biotchnology and Bioengeneering. 110 (2), 471-483 (2013).
Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods in Molecular Biology. 503, 65-88 (2009).
Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnology Journal. 9 (3), 415-425 (2014).
Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (22), 11984-11989 (2000).
Vrzheshch, P. V., Akovbian, N. A., Varfolomeyev, S. D., Verkhusha, V. V. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Letters. 487 (2), 203-208 (2000).
Firer, M. A. Efficient elution of functional proteins in affinity chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 433-442 (2001).
Pabst, T. M., et al. Engineering of novel Staphylococcal Protein A ligands to enable milder elution pH and high dynamic binding capacity. Journal of Chromatography A. 1362, 180-185 (2014).
Müller, E., Vajda, J. Routes to improve binding capacities of affinity resins demonstrated for Protein A chromatography. Journal of Chromatography B. 1021, 159-168 (2016).
Shamloul, M., Trusa, J., Vadim, M., Vidadi, Y. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. Journal of Visualized Experiments. (86), 51204 (2014).
Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
Saxena, L., Iyer, B. K., Ananthanarayan, L. Purification of a bifunctional amylase/protease inhibitor from ragi (Eleusine coracana) by chromatography and its use as an affinity ligand. Journal of Chromatography. B. 878 (19), 1549-1554 (2010).
Kurppa, K., Reuter, L. J., Ritala, A., Linder, M. B., Joensuu, J. J. In-solution antibody harvesting with a plant-produced hydrophobin-Protein A fusion. Plant Biotechnology Journal. 16 (2), 404-414 (2018).
Menzel, S., et al. Optimized Blanching Reduces the Host Cell Protein Content and Substantially Enhances the Recovery and Stability of Two Plant-Derived Malaria Vaccine Candidates. Frontiers in Plant Science. 7 (159), 1-7 (2016).
Yigzaw, Y., Piper, R., Tran, M., Shukla, A. A. Exploitation of the adsorptive properties of depth filters for host cell protein removal during monoclonal antibody purification. Biotechnology Progress. 22 (1), 288-296 (2006).
Menzel, S., et al. Downstream processing of a plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate. Protein Expression and Purification. 152, 122-130 (2018).
Vöpel, N., Boes, A., Edgü, G., Beiss, V. Malaria vaccine candidate antigen targeting the pre-erythrocytic stage of Plasmodium falciparum produced at high level in plants. Biotechnology Journal. 9 (11), 1435-1445 (2014).
Lee, C. W., Wang, H. J., Hwang, J. K., Tseng, C. P. Protein thermal stability enhancement by designing salt bridges: a combined computational and experimental study. PLoS ONE. 9 (11), e112751 (2014).
Zhu, L., Cheng, F., Piatkowski, V., Schwaneberg, U. Protein engineering of the antitumor enzyme PpADI for improved thermal resistance. Chembiochem. 15 (2), 276-283 (2014).
Khanal, O., et al. Contributions of depth filter components to protein adsorption in bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1938-1948 (2018).
Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5 (2), 138-142 (2014).
Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. Journal of Visualized Experiments. (110), e53940 (2016).
Fink, D., et al. Ubiquitous expression of the monomeric red fluorescent protein mCherry in transgenic mice. Genesis. 48 (12), 723-729 (2010).
Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. Journal of Chromatography A. 1221, 57-70 (2012).
Figueira, M., Laramée, L., Murrell, J. C., Groleau, D., Míguez, C. Production of green fluorescent protein by the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 195-200 (2001).
Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in enzymology. 326, 245-254 (2000).
Sainsbury, F., Jutras, P. V., Vorster, J., Goulet, M., Michaud, D. A. Chimeric Affinity Tag for Efficient Expression and Chromatographic Purification of Heterologous Proteins from Plants. Frontiers in Plant Science. 7, 141-141 (2016).
Krupka, M., et al. The Position of His-Tag in Recombinant OspC and Application of Various Adjuvants Affects the Intensity and Quality of Specific Antibody Response after Immunization of Experimental Mice. PLoS ONE. 11 (2), e0148497 (2016).
Goel, A., et al. Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct. Biochimica et Biophysica Acta. 1523 (1), 13-20 (2000).
Tustian, A. D., et al. Development of a novel affinity chromatography resin for platform purification of bispecific antibodies with modified protein a binding avidity. Biotechnology Progress. , (2018).
Zandian, M., Jungbauer, A. An immunoaffinity column with a monoclonal antibody as ligand for human follicle stimulating hormone. Journal of Separation Science. 32 (10), 1585-1591 (2009).
Kelley, B. Very large scale monoclonal antibody purification: the case for conventional unit operations. Biotechnology Progress. 23 (5), 995-1008 (2007).
Petrou, C., Sarigiannis, Y., S, K. o. u. t. s. o. p. o. u. l. o. s. Ch. 1. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering. , 1-21 (2018).
Menegatti, S., et al. Design of protease-resistant peptide ligands for the purification of antibodies from human plasma. Journal of Chromatography A. 1445, 93-104 (2016).
Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , 1-7 (2019).

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Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins – Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).