活联甘蔗，用于亲和色谱树脂的快速发展 - 抗体捕获作为案例研究

1. 培育转基因烟草植物 注：DFE融合蛋白和转基因植物的生成设计在5、17别处作了描述。 在土壤中发芽转基因烟草幼苗。用1.0克的灌溉植物L-1肥料溶液。当植物生长到直径为 ±0.04 m 时，将其转移到单个 100 mm x 100 mm x 60 mm（长度、宽度、高度）的盆中。 在具有16小时光周期（25/22°C光/暗温度机制）的温室中培育转基因烟草植物，具有70%的相对湿度和1.0克的自动施肥。L-1肥料溶液每小时15分钟。 7周后，收获除植物茎底部的四片叶外的所有叶子。立即处理收获的叶子，如下所述。 2. 宿主细胞蛋白的热沉淀 在不锈钢加热容器（0.3 m x 0.3 m x 0.3 m）中设置一个工作体积为 20 L 的水浴。开始时，在水浴中放置一个磁泵，以5Lmin-1的流量永久搅拌液体。在水浴上安装可调节恒温器，用于温度控制（步骤 2.4 和 2.8）。警告：以下所有步骤高达 2.10 涉及热液体的处理。佩戴适当的个人防护设备，包括热绝缘手套和护目镜。 在水浴中加入15L的去离子水，将液体加热至70°C。 将装有 5 L 去离子水的 10 L 铲斗放在磁力搅拌器上。将磷酸钠加入120 mM的最终浓度。使用10M盐酸将pH-调整至8.14。当所有组件溶解后，从步骤 2.2 将产生的浓缩发泡缓冲液 （5 L） 添加到水浴中。 搅拌水浴，直到温度达到70°C。如有必要，使用 10 M 盐酸将 pHH 调节到 8.14。达到所需温度和 pH 值后，继续搅拌至少 15 分钟，以确保整个组件处于热平衡状态。 准备一个 20 L 桶（0.3 m x 0.3 m x 0.3 m），在 ±17 °C 温度下充满去离子水（步骤 2.9 需要）。 从步骤1.3制备400克收获的烟叶等分。将一个等分放入穿孔篮中（0.2 米 x 0.2 米 x 0.2 米;孔宽至少 0.02 m x 0.02 m）。避免用植物材料过度填充篮子或将叶子包装得太紧，以免损坏组织。 从步骤 2.4 开始，将篮完全浸入热发白缓冲液中，并确保所有叶子都留在液体表面之下。如有必要，使用热稳定的硅胶勺将叶子保持在表面之下。 在泵仍在搅拌液体时，在发泡液中孵育烟叶 1.5 分钟。在整个潜伏期监测液体温度。避免用烟叶堵塞泵入口。 从发泡缓冲液中取出烟篮，将残留的缓冲液从叶子中取出30s。将烟篮转移到装满冷水的桶中（从步骤2.5开始），将叶子浸泡30s。取出篮子，从叶子中排出残留水。在均质化之前为 30 s（步骤 3）。 重复步骤2.6至2.9，从2.6起使用新鲜的等分，直到处理整个收获的生物量。持续监控和调整水浴中洗浴缓冲液的pH和温度。注：当处理整个生物量需要几个发泡周期时，在冰上储存的白化植物材料可以储存长达 30 分钟。发白的叶子也可以储存在真空密封袋中，在+80°C下至少3周。但是，建议立即处理，因为长时间存储会降低 DFE 产量。 3. 蛋白质提取和澄清 警告：以下步骤涉及带旋转刀片的搅拌机。在电机单元上通电或安装时，请勿在搅拌机容器中工作。 将150克（湿质量）的白烟叶（步骤2.9）放入搅拌机容器内，并加入450 mL的萃取缓冲液（50 mM磷酸钠、500 mM氯化钠、10 mM脱硫钠、pH 7.5）。紧闭搅拌机盖，防止植物材料或缓冲液溢出。 使叶子均匀化3倍30秒，每个脉冲之间有30秒的断裂。确保所有叶子均质化，并且没有粘到搅拌机容器的顶部。如有必要，在破裂时打开搅拌机，并使用干净的硅胶勺将粘在容器上部的叶子向下推下。 均质化后，取一个1.0 mL的均质样品进行后续分析（步骤7）。 在足够大小的容器中收集均质物（例如，如果使用总生物量为 1.0 kg 时，请使用容量至少为 5 L 的容器）。重复步骤 3.1 到 3.3，直到所有变白的生物量均质化。 将袋式过滤器安装到过滤器安装件中，并将另一个尺寸合适的容器（参见 3.4）放在组件下方。以 ±0.15 Lmin-1的速率将均质剂涂在袋过滤器中。在每升后采集袋液样品，以便进行后续分析（步骤7），并使用浊度计或类似装置测量袋滤池的浊度，作为1：10稀释提取缓冲液。 进一步明确袋滤池使用0.02 m2的K700（顶部）和KS50（底部）深度过滤层组合每升袋滤池。施加 3.0 L 最小-1μm-2的流量，最大压力为 0.2 MPa。然后，通过前述的0.2μm无菌过滤器，通过澄清的滤液去除残余颗粒。 4. DFE 亲和力连体净化 使用洗脱缓冲液（10 mM磷酸钠、300 mM imidazole、pH 7.4）、洗涤缓冲液（10 mM磷酸钠，pH 7.4）和平衡缓冲液（20 mM磷酸钠、500 mM氯化钠、pH 7.4）制备快速蛋白质液相色谱系统。每公斤叶生物量（±2.5 L深度滤液）安装含有±50 mL的合合交联甘蔗脂的柱。 通过应用 5 列体积 （CV） 的 200 mM 硫酸镍溶液，用 5 CV 洗脱缓冲液清洗该柱。使用 50 cmh-1的流速，并监控 260、280 和 558 nm 的 UV 信号，用于所有后续色谱步骤。 使用 10 CV 平衡缓冲器对列进行平衡。然后，将澄清的植物提取物（从步骤 3.6）的 50 CV 加载到条件柱上。 用 10 CV 的洗涤缓冲液清洗柱子。使用 5 CV 洗脱缓冲液洗脱 DFE 融合蛋白，并在 280 nm 和 558 nm 的 UV 信号增加到高于基线 5 mAU 时收集含产物的分数。 从洗脱分数中抽取 0.2 mL 样品，以测量总可溶性蛋白 （TSP） 浓度（步骤 7.1）、DFE 浓度（步骤 7.2 和 7.3）和 DFE 纯度（步骤 7.4）。 在色谱系统上安装含有 ±50 m0 mL 的交联 dextran 树脂的柱。使用 5 CV 耦合缓冲液（200 mM HEPES、500 mM 氯化钠、pH 8.5）对柱进行平衡。注入 10 mL 的 DFE 洗脱分数（步骤 4.4）进行缓冲液交换，并在 280 和 558 nm 处监测紫外线吸收。 一旦 280 nm 和 558 nm 处的 UV 信号增加到高于基线的 5 mAU 以上，则收集包含 DFE 的分数。取0.2 mL样品，确定TSP浓度、DFE浓度和DFE纯度（步骤7）。 在离心机中，使用离心集中管在3000 x g下在4°C下将纯化DFE样品（从步骤4.7）浓缩至15g L-1，30分钟。继续耦合反应（步骤 5）。注：如果浓度或耦合步骤不能立即执行，则将 DFE 溶液储存在 4°C。 5. 将DFE与已激活的交联甘蔗树脂耦合 注：在满足所有耦合设备和解决方案之前，请勿更换用于存储 NHS 激活柱的异丙醇。切勿让柱子干涸。 设置实验设计（DoE）模型，以pH、缓冲液组合物和DFE浓度为因子，优化DFE与活性树脂的耦合。DoE 方法的详细信息将在其他地方15进行说明。 在浓度范围为 0.5±15 g* 的浓度范围内制备亲和配体溶液（从步骤 4.8 开始）L-1或 DoE 中定义，并将其存储在冰上，直到耦合反应准备就绪（步骤 5.5）。用DFE溶液填充至少10个2 mL注射器，并准备一个适配器，将注射器安装在床容量为1.0 mL的NHS激活的交联琼脂柱上。 对于用于耦合的每10列，制备30 mL的失活溶液（0.5M乙醇胺、0.5 M氯化钠、pH 8.3）、30 mL的低pH溶液（0.1M醋酸钠、0.5M氯化钠、pH 4.0）和10 mL的储存溶液（0.05 M磷酸二钠），0.1% （m/v） 阿齐德钠，pH 7.0）。 在管子中制备20 mM盐酸，并在冰上孵育至少20分钟。准备一个精密刻度，以监测耦合反应过程中所有步骤的流过分数（步骤5.7）。 打开密封的 NHS 激活交联琼脂柱，并将注射器适配器安装在柱入口。在将缓冲液连接到注射器之前，通过在适配器入口上施加一滴缓冲液，防止任何空气进入柱。 用6 mL的冰冷1 mM盐酸（从步骤5.4开始）以<1 mLmin-1的流速清洗柱子，并立即进入步骤5.7。 使用 2 mL 注射器以 <1 mLmin-1的流速注射 1.5 mL DFE 溶液（步骤 5.2），并在精度刻度（步骤 5.4）上收集流过分数，以便后续分析（步骤 7）。密封两端的柱子，在 22°C 下孵育 15-45 分钟，具体取决于 DoE 设置。 注入6 mL的失活溶液，然后注入6 mL的低pH溶液，流速为<1 mL min-1，从树脂中去除非共价结合的配体。然后注入6 mL的失活溶液，孵育柱15分钟。 将 6 mL 的低 pH 溶液注入柱中，然后注入 6 mL 的失活溶液。然后，再向柱中注入6mL的低pH溶液。 将 2 mL 的存储溶液注入柱中，并在 4°C 下存储。 6. 测试从澄清植物提取物中净化mAbs 从首选的基于细胞的表达系统中制备含有2F55或上清液的澄清植物提取物100mL，也含有2F5。 制备平衡缓冲液（20 mM磷酸钠，500 mM氯化钠，pH 7.4），低pH洗脱缓冲液（0.05 M柠酸酸，0.05 M氯化钠，pH 4.0~3.25），以及高离子强度洗脱缓冲液（1.0~4.0 M氯化镁，0.1M HEPES，pH 8.0） 用缓冲液冲洗色谱系统。在色谱系统上安装 DFE 亲和柱（从步骤 5.10 开始），并在 1.0 mL 最小-1的流速下与 5 CV 平衡缓冲液进行平衡。在 280 nm 处监测紫外线吸收。注：将植物提取物或细胞培养上清液加载到柱上会导致背压增加。将高压警报设置为 0.2 MPa，以避免损坏色谱系统或 DFE 柱。 以0.5 mLmin-1的流速将澄清的植物提取物或上清液（步骤6.1）加载到柱上，以保证接触时间为2分钟。 收集2 mL分数的流经样品，以进行突破性曲线重建（步骤7.3）。如果无法立即进行样品分析，则将流过样品储存在 4°C。 使用 6 CV 平衡缓冲液清洗列。在此步骤的开头、中间和结尾收集洗涤的样本。 具有 5 CV 低 pH 洗脱缓冲液或高离子强度洗脱缓冲液（0.1 M HEPES，1.25 M 氯化镁，pH 8.0）的 Elute mAb 2F5。当 UV 280 nm 信号增加到高于基线的 5 mAU 时，收集 DFE 分数。 优化每个表位-抗体对的洗脱缓冲液。对于 2F5，1.25 M 氯化镁实现了产品回收和配体稳定性之间的最佳平衡。注：氯化镁溶液容易沉淀。因此，将氯化镁溶解在±700 mL的水中。将 HEPES 单独溶解在 100 mL 水中，并将 pHH 调节到 8.0。将溶解的氯化镁溶液添加到 HEPES 溶液中，并将水添加到 1.0 L 的最终体积中。溶解氯化镁后不要调整pH，因为这会导致沉淀。 使用布拉德福德方法分析步骤 6.4_6.6 期间采集的所有样品、多氯二硫酸锂聚丙烯酰胺凝胶电泳 （LDS-PAGE） 和表面质子共振 （SPR） 光谱（步骤 7）。 7. 样本分析 使用布拉德福德方法18，19测量TSP浓度。 在三合一中，将每个样品的移液器 2.5 μL 放入 96 孔板的单个孔中。使用八种牛血清白蛋白 （BSA） 标准，涵盖范围为 0~2，000 mg*L-1. 在每个井中加入 200 μL 的布拉德福德试剂，然后轻轻上下移液进行混合。保持移液器水平，以避免形成扭曲后续读出的气泡。 在 22°C 下孵育板 10 分钟，并在分光光度计中测量 595 nm 的吸光度。根据通过 BSA 参考点的标准曲线计算样本中的 TSP 浓度。 通过荧光测量法量化 DFE 在三联中，将每个样品的移液器50μL放入黑色96孔半面积板的单孔中。包括六个DsRed标准，涵盖范围0~225毫克*L-1. 使用 530 × 30 nm 激励滤波器和分光光度计中的 590 ± 35 nm 发射滤波器测量荧光两次。根据通过 DsRed 参考点的标准曲线计算样本中的 DFE 浓度。 通过SPR光谱20测量2F5浓度。 准备 HBS-EP 运行缓冲液 （10 mM 4-（2-羟基）-1-管道乙烷酸 （HEPES）， 3 m M 乙烯二甲四乙酸 （EDTA）， 150 mM 氯化钠， 0.005% v/v Tween-20， pH H 7.4）， 并通过 0.2m 真空吸尘器进行过滤消毒瓶顶过滤器。将缓冲液解气15分钟。 在对接卡博格甲基化 dextran 表面芯片并使用主函数对系统进行平衡之前，将 HBS-EP 运行缓冲器连接到 SPR 仪器。以 30 μL 最小-1的流速开始手动运行，并在流量 30 μL 最小 -1 的流量下，在流细胞 1 和 2 上交替注入 30 mM 盐酸和 25 mM 氢氧化钠（每次注射两次），从而对芯片表面进行调节，流量为 30 μL 最小-1 1 分钟。 准备300 μL的500毫克*L-1蛋白 10m 醋酸钠（pH 4.0）中的溶液。含有0.4M 1-乙-3-（3-二甲基氨基丙基）和0.1M氢酸酯（EDC）和0.1M NHS的解冻小瓶，在16，000 x g下用离心机1分钟，然后混合70μLEDC和70μL的NHS。 将 EDC/NHS 混合物和蛋白质 A 溶液转移到 7 mm 塑料样品小瓶，并放置在样品架中。在流量1和2的流量下，将EDC/NHS混合物注入流细胞1和2，以10μL最小-1的流量10分钟，激活卡博格甲基化脱氧核片表面。 将蛋白质 A 与活性的甲基化脱氧核素表面耦合，在流细胞 2 上注入蛋白质 A 溶液，流速为 15 μL 最小-1 15 分钟。 在耦合蛋白质A时，将1.0M氢盐酸乙醇胺（pH 8.5）的瓶解冻，并在16，000 x g下将离心机解冻1分钟，将150μL转移到7毫米塑料小瓶中，并放入仪器中。步骤 7.3.5 完成后，通过在流单元 1 和 2 上注入乙醇胺溶液，以 10 μL 最小-1的流速 7 分钟来停用芯片表面。 在流单元1和2上交替注入30 mM盐酸和25 mM氢氧化钠（每次注射两次），在流率为30 μL-1 0.5分钟，从而调节芯片表面。 在HBS-EP运行缓冲液中制备浓度为500μg的抗体2F5标准*L-1和含有 HBS-EP 中 2F5 的稀释样品，最终浓度在 20~1，000 μg*L-1.以30μL最小-1的流速在流细胞1和2上注入样品和标准，3分钟。每15个样品后注射2F5标准。 从每个样品的流单元2（测量单元）信号中减去流单元1（参考单元）的相对单位（RU）信号，并根据2F5标准注射的RU信号计算抗体浓度。 每次样品或标准注射后，在流细胞1和2上注入30 mM盐酸，流速为30μL-1，以0.5分钟再生芯片表面。 将步骤 6.4 中每个流过样品的 2F5 浓度与流通体积进行绘制，以获得 2F5 突破曲线。当负载 2F5 浓度达到 10% 时，计算注入 2F5 的量，以获得 10% 的动态绑定容量 （DBC）。 通过 LDS-PAGE 分析蛋白质样本。 打开一个即用型 4-12% BisTris LDS 聚丙烯酰胺凝胶，并将其放入电泳模块中。将 800 mL 的运行缓冲液（50 mM MES、50 mM Tris 碱基、0.1% （m/v） SDS、1 mM EDTA、pH 7.3）转移到模块中，并加入 0.5 mL 的抗氧化溶液。 在1.5 mL反应管中，将10μL的加载缓冲液与4μL的还原剂和26μL的蛋白质样品混合。在80°C下在热块中孵育管10分钟。将管在 500 x g下离心 30 s。 将 LDS 聚丙烯酰胺凝胶（每通道 10 μL 样品）加载，并在单独的通道中加载 5 μL 的预染色蛋白质标准 （10-180 kDa）。 关闭电泳室并连接电源。电泳应运行 40 分钟，在常数 200 V 下运行。 从电泳室中取出凝胶。在 19 rpm 的摇床上打开凝胶奶机，在水中清洗凝胶 15 分钟。在 19 rpm 的摇床上将凝胶在染色溶液中染色 1 小时。 在 19 rpm 的摇床上将凝胶在水中污渍 1 小时。使用胶片扫描仪扫描凝胶。