تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة
Summary
في هذا الإجراء، يتم تعطيل الرباط الظهاري القائم على DsRed لإنتاج راتنج تقارب انتقائي للغاية لالتقاط الأجسام المضادة أحادية النسيلة من مستخلصات النباتات الخام أو اللاتابات ثقافة الخلية، كبديل للبروتين A.
Abstract
عادة ما يتم تحقيق تنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) من خلال البروتين A الكروماتوغرافيا تقارب، والتي يمكن أن تمثل ما يصل إلى 25٪ من تكاليف العملية الإجمالية. وبالتالي، فإن خطوات الالتقاط البديلة والفعالة من حيث التكلفة ذات قيمة بالنسبة للصناعة التحويلية على نطاق صناعي، حيث يتم إنتاج كميات كبيرة من الكمية الواحدة من الكمية. هنا نقدم طريقة لشل حركة النعت الظهاري ة المستندة إلى DsRed إلى راتنج أجاروز مرتبط ة عبر يسمح بالتقاط انتقائي للجسم المضاد 2F5 الذي يبطل مفعول فيروس نقص المناعة البشرية من مستخلصات النباتات الخام دون استخدام البروتين A. تم دمج ELDKWA الظهارة الخطية لأول مرة وراثيا إلى البروتين الفلورسنت DsRed وتم التعبير عن البروتين الانصهار في التبغ المعدلوراثيا(Nicotiana tabacum) النباتات قبل تنقية عن طريق الكروماتوغرافيا المعدنية أيونتقارب المعطلة. وعلاوة على ذلك، تم تحسين طريقة تقوم على الأجاروز المتصلة بتنشيط لكثافة الأربطة العالية، واقتران فعال وتكلفة منخفضة. وكانت درجة الحموضة وتكوين المخزن المؤقت وتركيز الرباط القابل للذوبان أهم المعلمات خلال إجراء الاقتران، الذي تم تحسينه باستخدام نهج تصميم التجارب. وقد تم اختبار الراتنج تقارب الناتجة عن قدرتها على ربط انتقائي mAb الهدف في استخراج مصنع الخام وتم تحسين العازلة elution لاسترداد mAb عالية، نشاط المنتج والاستقرار الراتنج تقارب. ويمكن بسهولة تكييف هذه الطريقة مع الأجسام المضادة الأخرى مع epitopes الخطية. الراتنجات الجديدة تسمح ظروف الإلتواء ألطف من البروتين A ويمكن أيضا أن تقلل من تكاليف خطوة التقاط الأولي لإنتاج mAb.
Introduction
المنتجات الصيدلانية الحيوية مهمة لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض في كل فرع تقريبا من فروع الطب1. الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) تهيمن على سوق الأدوية الحيوية، مع المبيعات في جميع أنحاء العالم من المتوقع أن تصل إلى ما يقرب من 110 مليار يورو في عام 20202. منصة التعبير المفضلة لmAbs هي خطوط الخلايا المبيض الهامستر الصينية، والتي تنتج عادة titers mAb عالية تصل إلى 10 g∙L-1 في ثقافة supernatant3،4. ومع ذلك، فإن إنتاج mAbs في الثقافات الخلايا الثدييات مكلفة بسبب ارتفاع تكلفةالمتوسطة والحاجة إلى التخمير المعقمة 5. منصات التعبير البديلة مثل النباتات يحتمل أن تقدم نهجا أسرع وأبسط وأقل تكلفة وأكثر قابلية للتطوير للتصنيع الصناعي6،7.
بالإضافة إلى التكاليف المرتبطة بثقافات الخلايا الثدييات، والاستخدام الواسع النطاق للبروتين A الكروماتوغرافيا تقارب لالتقاط المنتج هو محرك تكلفة رئيسية للإنتاج الصناعي من mAbs. البروتين A موجود بشكل طبيعي على سطح الخلايا المكورات العنقودية وربطت بجزء من التبلور (Fc) المنطقة من بعض المورين والأجسام المضادة البشرية، وبالتالي بمثابة آلية دفاعية للتهرب من الجهاز المناعي الفكاهي8. البروتين A أصبح معيار الذهب الصناعة لالتقاط mAbs من supernatants ثقافة الخلية ويستخدم أيضا على نطاق واسع من قبل مجتمع البحوث لأنه انتقائي للغاية، وعادة ما تحقق نقاء mAb من ~ 95٪ في خطوة واحدة8. ومن غير المستغرب أن مبيعات البروتين A على مدى العقدين الماضيين قد عكست بشكل وثيق مبيعات mAbs8. اعتمادا على مقياس الإنتاج، وتكاليف البروتين A يمكن أن تتوافق مع أكثر من 25٪ من إجمالي تكاليف العملية وبالتالي تؤثر على سعر السوق من mAbs العلاجية، والتي يمكن أن تصل إلى 2000 غرام-15،9. ولذلك، فإن راتنجات الكروماتوغرافيا البديلة مع أداء تنقية مماثل لديها القدرة على خفض تكاليف الإنتاج إلى حد كبير، مما يجعل العلاجات المستندة إلى الأجسام المضادة في متناول عدد أكبر من المرضى10،11 ،12. هذه البدائل قد تتحايل أيضا على مساوئ البروتين A اللونية، بما في ذلك ظروف الإلتواء القاسية عند درجة الحموضة المنخفضة (عادة <3.5) التي يمكن أن تسبب mAbs للخضوع لتغيرات مطابقة تعزز التجميع13 . الأهم من ذلك، البروتين A هو انتقائي فقط لمنطقة Fc من بعض الفئات الفرعية IgG، لذلك الجزيئات غير وظيفية مع نطاقات ملزمة مقتطعة قد تشارك في تنقية مع المنتج سليمة5،في حين أن مشتقات mAb مثل شظايا متغير سلسلة واحدة لا تربط البروتين A على الإطلاق.
هنا، ونحن نصف الراتنج الكروماتوغرافيا تقارب بديل لالتقاط mAb 2F5 تحييد فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام الكتابة الخطية ELDKWA (حرف واحد رمز الأحماض الأمينية)5،14. نحن وراثيا تنصهر الظهارة 2F5 إلى C-محطة من البروتين الفلورسنت DsRed، الذي كان يعمل كناقل وجزيء مراسل، وأنتجت البروتين الناتج DsRed-2F5-Epitope (DFE) في التبغ المعدل وراثيا ( نيكوتيانا تاباكوم) النباتات. تم تنقية DFE من قبل خطوة واحدة شلت المعادن أيون تقارب اللونية (IMAC). تم تحقيق تجميد الرباط التقارب DFE النقي على راتنج أجاروز عبر مرتبطة عن طريق اقتران الكيميائية باستخدام N-هيدروكسيسوتشينيميد (NHS) تنشيط عبر الأعمدة agarose. ثم استخدمت التصاميم التجريبية الإحصائية لتحسين إجراء التعطيل واقتران الكفاءة15. تم تقييم استراتيجية تنقية mAb 2F5 من حيث نقاء الأجسام المضادة، والغلة والاستقرار في الأربطة. على النقيض من البروتين A، الذي يربط منطقة Fc، DFE ملزمة منطقة تحديد التكامل من 2F5، وضمان تنقية الجزيئات مع paratope سليمة. مفهومنا يمكن بسهولة تكييفها مع أي mAb مع epitope خطي أو غيرها من الأربطة التقارب القائم على الببتيد التي يمكن تحديدها بسهولة من قبل الدراسات microarray16.
الشكل 1: مخطط تدفق العمليات لإعداد راتنجات تقارب الظهارة التي يمكن استخدامها لالتقاط mAbs من مستخلصات النباتات الخام أو المنائج ثقافة الخلية. (أ) تم التعبير عن تقارب الرباط DFE في مصانع التبغ المعدلة وراثيا. تم تضمين خطوة هطول الأمطار الحرارية (B) قبل أن يتم تجانس الأوراق المقطوعة (C). (D) تم توضيح استخراج النبات الخام عن طريق الترشيح كيس، والترشيح عمق و0.2 م الترشيح المعقمة. (E) ثم تم تنقية DFE من قبل IMAC. (واو،ز) تم تعطيل ربط تقارب DFE المنقى على أعمدة أغاروز المرتبطة بـ EDC/NHS. (H) استخدمت الثقافات البكتيرية التي تحمل T-DNA ترميز الأجسام المضادة 2F5 للتعبير العابر في النباتات N. بنتهامايانا (I) نمت في phytotron. (ي) تم حصاد أوراق ن. بنتامايانا ومعالجتها كما هو موضح في D. (K) تم تنقية mAb 2F5 من استخراج أوضح باستخدام أعمدة تقارب DFE(L). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تطبيقات من الرواية تقارب راتينج
لقد أظهرنا أن راتنجات الكروماتوغرافيا المتقاربة المخصصة لالتقاط mAbs يمكن تصنيعها عن طريق تعطيل الرباط الذي يحتوي على epitope خاص بـ mAb إلى agarose عبر المرتبطة بـ NHS. لتصميم مثل هذا الراتنج، كان من الضروري معرفة تسلسل الظهارة واستخدام epitope خطي. الراتنجات الناتجة مفيدة لالتقاط mAbs لأنها يمكن أن تحل محل مكلفة البروتين A خطوات الكروماتوغرافيا تقارب. التفاعل بين 2F5 و DFE في دراسة الحالة لدينا تم التوسط من قبل النعت الربية-paratope ملزمة، لذلك يجب أن يكون لدينا ligand أكثر انتقائية من البروتين A، الذي يربط إلى منطقة Fc من معظم المورين وIgGs الإنسان. لأن هناك حاجة إلى الأربطة الفردية لكل mAb، قد تبدو طريقتنا في البداية مناسبة أساسا للأجسام المضادة التي يتم إنتاجها على نطاق واسع جدا. ومع ذلك، من خلال الجمع بين نهجنا مع التعبير السريع البروتين العابر القائم على النبات، يمكن إعداد الأربطة تقارب جديدة في أقل من 2 أسابيع27 مع الحد الأدنى من الجهد28. وبالتالي، فإن الطريقة هي أيضا مناسبة لتنقية mAb على نطاق صغير.
الإنتاج والتحسينات المحتملة للربط التقارب
النباتات تقدم منصة إنتاج سريعة وآمنة للربط التقارب5،29،30،مثل بروتين الانصهار DFE واردة في دراسة الحالة لدينا. وقلّل غسل المواد النباتية إلى حد كبير كمية بروتينات الخلايا المضيفة في خطوة واحدة، وتم دمجها بسهولة في روتين توضيح قياسي. ومع ذلك، كان استرداد ligand منخفضة في الإعداد الحالي، وربما يرجع ذلك إلى استقراره الحراري المعتدل وبعض غير محددة ملزمة لطبقات فلتر، كما ذكرت للمنتجات الأخرى31،32،33. هندسة الناقل لزيادة استقراره الحراري قد يساعد بالتالي على تحسين غلة الرباط في المستقبل، كما هو موضح لمرشح لقاح الملاريا CCT، إنزيم مضاد للورم PpADI أو mesophilic β-glucosidase34، 35و36. وينطبق الشيء نفسه على خطوة الترشيح العمق، حيث هندسة البروتين قد تساعد على الحد من غير محددة ملزمة لمادة فلتر37. ويمكن أيضا خفض تكاليف الإنتاج لDFE وligands مماثلة عن طريق تحسين الكفاءة العامة للتوضيح باستخدام flocculants أو إضافات فلتر38،39.
عندما يتم استخدام DsRed كناقل، فإنه يشكل مجمع رباعي. وهذا مفيد لأنه يزيد من عدد الepitopes لكل ligand، ولكنه قد يجعل أيضا الرباط أكثر عرضة للتفكيك أو denaturation أثناء الكروماتوغرافيا تقارب. بروتين الناقل الأحادي مثل mCherry قد يكون من الأفضل، لأنه مستقر عند درجة الحموضة منخفضة40،وإدراج تكرار جنبا إلى جنب من epitope من شأنه أن يزيد من متعطشا للربط وبالتالي زيادة قدرة الراتنج5، 26 , 41– وبالنسبة للبروتينات البسيطة التي تحمل الموجات الإنقلت (أي تلك التي ليس لها روابط ثنائيكبريتيد أو تعديلات ما بعد الترجمة) فإن نظم الإنتاج الميكروبية قد تقلل من تكاليف التصنيع وتجعل الأربطة أكثر قدرة على المنافسة مع البروتين ألف. على سبيل المثال، تم التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر في الخلايا البكتيرية مع العائد من ~ 1 غرام · كجم-1 الكتلة الحيوية، والتي من شأنها أن تقلل بشكل كبير من تكاليف إنتاج الأربطة42.
بغض النظر عن المضيف التعبير، كان مطلوبا ربط تقارب تنقية أثناء اقتران لتقليل تجميد بروتينات الخلية المضيفة أو مكونات وسائل الإعلام التي يمكن أن تقلل خلاف ذلك انتقائية الراتنج والقدرة. إدراج علامة بولي الهيستيدين لتنقية IMAC زيادة النقاء إلى ~ 90٪ في خطوةواحدة، وتسهيل إنتاج ligand سريع وغير مكلفة 5،43،44. ومع ذلك، فإن موقف علامة الانصهار مهم لأنه لديه القدرة على إعاقة بشكل معقم ملزم الظهارية أو للحث على انشقاق إما العلامة أو epitope من الناقل45،46.
تعطيل الرباط التقارب على أعمدة الكروماتوغرافيا التي تنشطها دائرة الصحة الوطنية
وقد تم التعطيل يدويا أو باستخدام نظام كروماتوغرافيا. ويبدو أن أحجام التخزين المؤقت الصغيرة لكل عمود تفضل المناولة اليدوية (على سبيل المثال، بسبب الحد الأدنى من أحجام النفايات). ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة إلى أعمدة متعددة/أكبر، فإن نظام الكروماتوغرافيا يجعل من السهل التحكم في ظروف الاقتران (مثل معدلات التدفق المنظمة) وبالتالي فمن الأرجح أن يحقق نتائج قابلة للاستنساخ من حيث DBC. تشير بياناتنا إلى أن المخزن المؤقت للاقتران ودرجة الحموضة لها تأثير هام على كفاءة الاقتران وتكاليف العمود الإجمالية. عوامل الفرز التي تؤثر على رد فعل اقتران وتعديلها لكل بروتين الناقل (أو حتى لكل الناقل ligand الانصهار) يمكن بالتالي تحسين كفاءة اقتران وأداء الراتنج، ونحن نوصي هذا النهج.
اختبار العزلة 2F5 باستخدام الراتنج تقارب DFE
إنتاج المنتج والنقاء هي جوانب هامة من أداء الراتنج، وفي حالة DFE حققنا العائد من 105 ± 11٪ (± SD، ن = 3) ونقاء 97 ± 3٪ (± SD، n = 3)، وهو ما يمكن مقارنته مع أداء الراتنجات البروتين A القياسية25 ،26. مؤشر أداء رئيسي آخر للراتنجات بشكل عام (وخاصة بالنسبة لتلك التي تقوم على ربط اتّصال التقاربيّة) هو DBC عند 10% من المنتجات، لأن هذه المعلمة تؤثر على كمية الراتنج المطلوبة لعملية محددة وبالتالي التكاليف. ل ال [دف] [ليغد], كان ال [دبك] أوّليّة حوالي 4 [غ]· L-1 الراتنج، وهو ~ 13٪ من القيمة المقابلة للبروتين A في ظل ظروف مماثلة (فقط 2 دقيقة وقت الاتصال)25،47 ولكن حوالي 15 أضعاف أعلى بالمقارنة مع راتنجات التقارب مخصصة أخرى مثل المضادة للFSH المناعية ligand باستخدام نفس وقت الإقامة من 2 دقيقة48. انخفض DBC من DFE إلى 15٪ من قيمة البداية بعد 25 دورات الربط وelute، في حين أن هناك حاجة إلى أكثر من 50 دورات لنفس الخسارة من DBC في الراتنجات البروتين A التجارية49. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن الناقل لدينا لم يتم تحسينها حتى الآن إلى نفس المدى كما البروتين A، الذي تم التحقيق بشكل شامل وتحسينعلى مدى العقود الأربعة الماضية8.
حتى الآن قمنا بتحسين استقرار الراتنج واستعادة المنتج عن طريق التحول من العازلة انخفاض درجة الحموضة elution إلى تركيز عال من كلوريد المغنيسيوم (الشكل3)، كما أوصى في الدراسات السابقة13. اللون الأحمر المميز للربط تقارب لم تتلاشى إلى حد كبير خلال 25 دورات ربط وelute، لذلك نحن نتكهن بأن البروتياز النباتية الذاتية في استخراج النبات أوضح31 قد يكون اقتطاع وبالتالي تعطيل epitope من الليغاان. ولذلك، فإن تصميم الوصلات المقاومة للبروتياز لربط الناقل والظهارية قد يساعد على الحفاظ على DBC الأولي على مدى عدد موسع من الدورات. وبالنظر إلى التعبير السريع والبسيط وتنقية الرباط DFE، واقترانه مباشرة إلى راتنجات الكروماتوغرافيا التجارية، وغلة منتجاتها الممتازة ونقاءها، نعتقد أن أسلوبنا يوفر بديلا ً مناسباً للبروتين A لل تنقية mAbs ومشتقات الأجسام المضادة التي لا تربط البروتين A، وخاصة إذا كان التحسينات على الناقل والرابط يمكن تحسين DBC واستقرار ligand. وقد أيد هذا الافتراض من قبل الفرق الصغير في ثابت التفكك من DFE تنقية والبروتين A-تنقية 2F5 الأجسام المضادة5،مما يشير إلى أن لدينا ربط تقارب جديد يسمح باستعادة mAbs عالية الجودة.
الفوائد والقيود الحالية للطريقة
إنتاج الرباط تقارب كاندماج وراثي مع بروتين الناقل يزيد من الذوبان في المخازن المؤقتة المائية وبالتالي التوافق مع ظروف اقتران ligand نموذجية. وعلى النقيض من ذلك، قد تكون الببتيدات الفارغة المستمدة من تركيب الببتيد المرحلة الصلبة الذوبان محدودة في ظل هذه الظروف بسبب تسلسلها50، والتي لا يمكن تغييرها لأنها تمليها سلسلة الأحماض الأمينية من epitope المعترف بها من قبل mAb ل أن تكون تنقية. لذلك استخدم آخرون توليف على الراتنج من الأربطة الببتيد51. وكانت قدرة الربط ثابت من الراتنج الناتجة عالية (~ 80 غرام · L-1)،ولكن عملية إعداد الراتنج طويلة، لم يتم الإبلاغ عن قدرة ملزمة ديناميكية والنقاء والانتعاش التي تم الحصول عليها كانت أقل مما كانت عليه في نهجنا. ميزة إضافية من ربط البروتين الانصهار في نطاق المختبر هو أن ligand والمتغيرات منها يمكن أن تنتج بسرعة، وتنقية واختبارها مع الحد الأدنى من الجهد في سهلة الاستخدام عالية من خلال نظام التعبير52.
والقيود الحالية للطريقة المعروضة هنا هي القدرة الدينامية المنخفضة للربط البالغة 3 ز· L-1 وخفضه 90٪ على مدى 25 دورات ربط وelute5. ويمكن معالجة هذه القيود في المستقبل عن طريق تطبيق شروط تحميل أقل صرامة واستبدال الناقل DsRed الحالي بمتغير هندسي أكثر استقرارا ً على التوالي. على سبيل المثال، مضاعفة وقت الاتصال الحالي من 2 إلى 4 دقائق لديه القدرة على مضاعفة قدرة الربط الديناميكي كما هو مبين لبعض راتنجات البروتين A26.
استكشاف الاخطاء
يسلط الجدول التالي الضوء على المشاكل المحتملة التي يمكن مواجهتها أثناءهذا البروتوكول ويوفر تلميحات حول كيفية حلها (الجدول 1).
| الجدول 1: المشاكل المحتملة التي يمكن مواجهتها والإصلاحات الممكنة. | |||
| خطوة البروتوكول | المشكله | Couse | اصلاح |
| 1 | النباتات لا تنمو | ظروف النمو المهددة | التحقق من الحموضة والموصلية من الأسمدة |
| التحقق من درجة الحرارة وظروف الضوء | |||
| 2 و 3 | كميات كبيرة من بروتينات الخلية المضيفة موجودة بعد استخراج | هطول الأمطار غير الكامل | تحقق من درجة الحرارة أثناء الغسل |
| تحقق من التحريض في حمام الغسل | |||
| 2 و 3 | لم يتم العثور على أي منتج في مستخلص النبات | درجة حرارة عالية جداً | التحقق من درجة الحرارة ودرجة الحموضة أثناء الغسل |
| درجة الحموضة في المخزن المؤقت ابيضاض منخفضة جدا | |||
| 3 | تبقى أجزاء الجذعية أو الأوراق الكبيرة بعد الاستخراج | خلط غير كامل في الخلاط | تأكد من أن المواد النباتية لا تشكل المكونات في الخلاط |
| 3 | زيادة الضغط السريع أثناء الترشيح العمق | تحديد عامل التصفية و/أو الاتجاه غير صحيح | التحقق من نوع عامل التصفية واتجاهه |
| 4 | القليل من البروتين الانصهار خلال الإلتوى / الكثير من البروتين الانصهار في التدفق من خلال | لم يتم شحن راتنج IMAC بالأيونات المعدنية | تحقق مما إذا كان راتنج IMAC مشحونًا بشكل صحيح بالأيونات |
| فقدت بروتين الانصهار علامة التقارب | تجنب أشعة الشمس الشديدة وارتفاع درجات الحرارة أثناء زراعة النباتات | ||
| 4 | بروتين الانصهار المفقود أثناء التركيز | بروتين الانصهار المرتبط بالغشاء | التحقق من نوع الغشاء |
| تأكد من أن عامل التركيز لم يكن مرتفعاً جداً | |||
| 5 | انخفاض العائد اقتران | تسلسل غير صحيح من اقتران الكاشف إضافة | التحقق من تسميات الكواشف وتسلسل الإضافة |
| إعداد غير صحيح للأعمدة قبل اقتران | التحقق من شروط preparaiton العمود | ||
| 5 و 6 | انخفاض مباب العائد | انخفاض التعبير mAb في الكتلة الحيوية النباتية | اختبار التعبير mAb في الكتلة الحيوية |
| انخفاض كثافة الرباط | تحقق من نقاء إعداد البروتين الانصهار | ||
| 7 | تركيزات بروتين منخفضة جدا / عالية في برادفورد حسب | تشكيل فقاعة أثناء الأنابيب | تحقق من وجود فقاعات في بالت 96 جيدا |
| 7 | تركيز منخفض من الماب أثناء قياس موارد البرنامج الخاصة | بروتين للخطر رقاقة | مقارنة مع نتائج mAb القياسية مع التركيز المعروف |
| تخفيف عينة غير صحيحة | التحقق من معدل التخفيف والمخزن المؤقت | ||
الجدول 1: إطلاق النار من المتاعب.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف بإبراهيم العامدي لزراعة نباتات التبغ المعدلة وراثياً والدكتور توماس راديماشر لتوفيره ناقلات تعبير التبغ. ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور ريتشارد م. تويمان على المساعدة التحريرية وماركوس ساك على المناقشات المثمرة بشأن هيكل ربط الأربطة المتقاربة في إطار التعليم الإنمائي. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل البرامج الداخلية Fraunhofer-Gesellschaft في إطار المنحة رقم. جذب 125-600164 والدولة من [نورث-رهين-وستفليا] تحت [ليستثنززنترم] منحة رقم 423 “شبكة, إنتاج متكيّفة”. وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة المالية الألمانية في إطار منحة فريق التدريب البحثي “تسليم المخدرات المستهدفة بالأورام” 331065168. دعمت شركة جنرال إلكتريك للرعاية الصحية نشر هذه المقالة المفتوح.
Materials
| 10L/20L Bucket | n/a | n/a | Blanching equipment |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| ÄKTApure | GE Helthcare | 29018226 | Chromatography system |
| Allegra 25R | Beckman Coulter | 369434 | Centrifuge |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Antibody 2G12 | Fraunhofer IME | n/a | Standard for SPR quantification |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Fuhr | 2632410001 | Bag filter |
| CanoScan 5600F | Canon | 2925B009 | Scanner |
| Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chelating Sepharose FF | GE Helthcare | 17-0575-01 | Chromatography resin |
| Cond 3320 | WTW | EKA 3338 | Conductometer |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n/a | DoE software |
| Discovery Compfort | Gilson | F81029 | Multichannel pipette |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Diverse bottles | Schott Duran | n/a | Glas bottles |
| Dri Block DB8 | Techne | Z381373 | Heat block |
| DsRed | Fraunhofe IME | n/a | Standart |
| EDTA | Carl Roth GmbH | 8043.2 | Buffer component |
| EnSpire | Perkin Elmer | 2390-0000 | Plate reader |
| ETHG-912 | Oregon Scientific | 086L001499-230 | Thermometer |
| F9-C | GE Helthcare | 29027743 | Fraction collector |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Buffer component |
| Hettich Centrifuge Mikro 200 | Hettich | 2400 | Centrifuge |
| HiPrep 26/10 | GE Helthcare | GE17-5087-01 | Chromtography column |
| HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL | GE Helthcare | 17-0716-01 | Chromatography columns |
| Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH | 4625.1 | Buffer component |
| Imidazole | Carl Roth GmbH | 3899.2 | Buffer component |
| K700 | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KM02 basic | IKA | n/a | Magnetic stirrer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Immersion circulator |
| Magnesium chloride | Carl Roth GmbH | KK36.2 | Buffer component |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Minisart 0.2 µm | Sartorius | 16534K | Filter unit |
| Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter | Thermo Fischer Scientific | 595-4520 | Vacuum filtration of SPR buffers |
| Nickel sulphate | Carl Roth GmbH | T111.1 | Buffer component |
| Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels | Invitrogen | NP0336BOX | LDS-PAA gels |
| Novex X-cell Mini Cell | Invitrogen | EI0001 | PAGE chamber |
| NuPAGE 20x running buffer | Invitrogen | NP0002 | Buffer concentrate |
| NuPAGE antioxidant | Invitrogen | NP0005 | Antioxidant |
| PageRuler protein ladder (10-180 kDa) | Invitrogen | 26616 | Protein standart |
| Perforated bucked | n/a | n/a | Blanching |
| PH 3110 | WTW | 2AA110 | PH meter |
| PowerPac HC | Biorad | 1645052 | Electrophoresis module |
| Protein A from Staphylococcus aureus | Sigma-Aldrich | P7837-5MG | Coating of SPR chips |
| Sephadex G-25 fine, cross linked dextran | GE Helthcare | 17003301 | Chromatography resin |
| Silicone spoon | n/a | n/a | Spoon |
| Simply Blue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Gel staining solution |
| Sodium acetate | Carl Roth GmbH | 6773.1 | Buffer component |
| Sodium acetate | Carl Roth GmbH | X891.1 | Media component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-100G | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Buffer component |
| Sodium citrate | Carl Roth GmbH | HN13.2 | Buffer component |
| Sodium bisulfite | Carl Roth GmbH | 243973-100G | Media component |
| Sodium phosophate | Carl Roth GmbH | T877.2 | Media component |
| SPR Affinity Sensor – High Capacity Amine | Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics | SPR-AS-HCA | SPR chip |
| SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer | Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics | n/a | SPR device |
| SSM3 | Stuart | 10034264 | Mini Gyro-rocker |
| Heated vessel, 20 L | Clatronic | n/a | Blanching chamber |
| Sterile syringes, 2 mL | B. Braun | 4606027V | Syringes |
| Syringe adpter (Union Luer F) | GE Helthcare | 181112-51 | Syringe adapter |
| TE6101 | Sartorius | TE6101 | Precision scale |
| Tween-20 (Polysorbate) | Merck | 8170721000 | Buffer component |
| Unicorn 6.4 | GE Helthcare | 29056102 | Chromatography software |
| Vacuum bags | Ikea | 203.392.84 | Plant storge |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| XK-26/20 column housing | GE Helthcare | 28-9889-48 | Chromtography column |
Referências
- Kesik-Brodacka, M. Progress in biopharmaceutical development. Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (3), 306-322 (2018).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Jayapal, K., Wlaschin, K. F., Hu, W. S., Yap, M. G. S. Recombinant Protein Therapeutics from CHO Cells – 20 Years and Counting. Chemical Engineering Progress. 103, 40-47 (2007).
- Kunert, R., Reinhart, D. Advances in recombinant antibody manufacturing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (8), 3451-3461 (2016).
- Rühl, C., Knödler, M., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. A linear epitope coupled to DsRed provides an affinity ligand for the capture of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1571, 55-64 (2018).
- Edgue, G., Twyman, R. M., Beiss, V., Fischer, R., Sack, M. Antibodies from plants for bionanomaterials. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1462 (2017).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Very-large-scale production of antibodies in plants: The biologization of manufacturing. Biotechnology Advances. 35 (4), 458-465 (2017).
- Bolton, G. R., Mehta, K. K. The role of more than 40 years of improvement in protein A chromatography in the growth of the therapeutic antibody industry. Biotechnology Progress. 32 (5), 1193-1202 (2016).
- Kelley, B. Industrialization of mAb production technology: the bioprocessing industry at a crossroads. MAbs. 1 (5), 443-452 (2009).
- Brochier, V., Ravault, V. High throughput development of a non protein A monoclonal antibody purification process using mini-columns and bio-layer interferometry. Engineering in Life Sciences. 16 (2), 152-159 (2016).
- Arakawa, T., Futatsumori-Sugai, M., Tsumoto, K., Kita, Y., Sato, H., Ejima, D. MEP HyperCel chromatography II: binding, washing and elution. Protein Expression and Purification. 71 (2), 168-173 (2010).
- Barroso, T. B., Aguiar-Ricardo, R. J., Roque, A. C. Structural evaluation of an alternative Protein A biomimetic ligand for antibody purification. Journal of Computer-aided Molecular Design. 28 (1), 25-34 (2014).
- Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O’Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography A. 1415, 83-90 (2015).
- Sack, M., et al. Functional analysis of the broadly neutralizing human anti-HIV-1 antibody 2F5 produced in transgenic BY-2 suspension cultures. FASEB Journal. 21 (8), 1655-1664 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study. Journal of Visualized Experiments. (83), 51216 (2014).
- Trasatti, J. P., Woo, J., Ladiwala, A., Cramer, S., Karande, P. Rational design of peptide affinity ligands for the purification of therapeutic enzymes. Biotechnology Progress. 34 (4), 987-998 (2018).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochemical Engineering Journal. 88, 162-170 (2014).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Current Protocols in Molecular Biology. 76 (Chapter 10), (2006).
- Buyel, F. J., Kaever, T., Buyel, J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5’UTR combination. Biotchnology and Bioengeneering. 110 (2), 471-483 (2013).
- Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods in Molecular Biology. 503, 65-88 (2009).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnology Journal. 9 (3), 415-425 (2014).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Vrzheshch, P. V., Akovbian, N. A., Varfolomeyev, S. D., Verkhusha, V. V. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Letters. 487 (2), 203-208 (2000).
- Firer, M. A. Efficient elution of functional proteins in affinity chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 433-442 (2001).
- Pabst, T. M., et al. Engineering of novel Staphylococcal Protein A ligands to enable milder elution pH and high dynamic binding capacity. Journal of Chromatography A. 1362, 180-185 (2014).
- Müller, E., Vajda, J. Routes to improve binding capacities of affinity resins demonstrated for Protein A chromatography. Journal of Chromatography B. 1021, 159-168 (2016).
- Shamloul, M., Trusa, J., Vadim, M., Vidadi, Y. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. Journal of Visualized Experiments. (86), 51204 (2014).
- Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
- Saxena, L., Iyer, B. K., Ananthanarayan, L. Purification of a bifunctional amylase/protease inhibitor from ragi (Eleusine coracana) by chromatography and its use as an affinity ligand. Journal of Chromatography. B. 878 (19), 1549-1554 (2010).
- Kurppa, K., Reuter, L. J., Ritala, A., Linder, M. B., Joensuu, J. J. In-solution antibody harvesting with a plant-produced hydrophobin-Protein A fusion. Plant Biotechnology Journal. 16 (2), 404-414 (2018).
- Menzel, S., et al. Optimized Blanching Reduces the Host Cell Protein Content and Substantially Enhances the Recovery and Stability of Two Plant-Derived Malaria Vaccine Candidates. Frontiers in Plant Science. 7 (159), 1-7 (2016).
- Yigzaw, Y., Piper, R., Tran, M., Shukla, A. A. Exploitation of the adsorptive properties of depth filters for host cell protein removal during monoclonal antibody purification. Biotechnology Progress. 22 (1), 288-296 (2006).
- Menzel, S., et al. Downstream processing of a plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate. Protein Expression and Purification. 152, 122-130 (2018).
- Vöpel, N., Boes, A., Edgü, G., Beiss, V. Malaria vaccine candidate antigen targeting the pre-erythrocytic stage of Plasmodium falciparum produced at high level in plants. Biotechnology Journal. 9 (11), 1435-1445 (2014).
- Lee, C. W., Wang, H. J., Hwang, J. K., Tseng, C. P. Protein thermal stability enhancement by designing salt bridges: a combined computational and experimental study. PLoS ONE. 9 (11), e112751 (2014).
- Zhu, L., Cheng, F., Piatkowski, V., Schwaneberg, U. Protein engineering of the antitumor enzyme PpADI for improved thermal resistance. Chembiochem. 15 (2), 276-283 (2014).
- Khanal, O., et al. Contributions of depth filter components to protein adsorption in bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1938-1948 (2018).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5 (2), 138-142 (2014).
- Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. Journal of Visualized Experiments. (110), e53940 (2016).
- Fink, D., et al. Ubiquitous expression of the monomeric red fluorescent protein mCherry in transgenic mice. Genesis. 48 (12), 723-729 (2010).
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. Journal of Chromatography A. 1221, 57-70 (2012).
- Figueira, M., Laramée, L., Murrell, J. C., Groleau, D., Míguez, C. Production of green fluorescent protein by the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 195-200 (2001).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in enzymology. 326, 245-254 (2000).
- Sainsbury, F., Jutras, P. V., Vorster, J., Goulet, M., Michaud, D. A. Chimeric Affinity Tag for Efficient Expression and Chromatographic Purification of Heterologous Proteins from Plants. Frontiers in Plant Science. 7, 141-141 (2016).
- Krupka, M., et al. The Position of His-Tag in Recombinant OspC and Application of Various Adjuvants Affects the Intensity and Quality of Specific Antibody Response after Immunization of Experimental Mice. PLoS ONE. 11 (2), e0148497 (2016).
- Goel, A., et al. Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct. Biochimica et Biophysica Acta. 1523 (1), 13-20 (2000).
- Tustian, A. D., et al. Development of a novel affinity chromatography resin for platform purification of bispecific antibodies with modified protein a binding avidity. Biotechnology Progress. , (2018).
- Zandian, M., Jungbauer, A. An immunoaffinity column with a monoclonal antibody as ligand for human follicle stimulating hormone. Journal of Separation Science. 32 (10), 1585-1591 (2009).
- Kelley, B. Very large scale monoclonal antibody purification: the case for conventional unit operations. Biotechnology Progress. 23 (5), 995-1008 (2007).
- Petrou, C., Sarigiannis, Y., S, K. o. u. t. s. o. p. o. u. l. o. s. Ch. 1. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering. , 1-21 (2018).
- Menegatti, S., et al. Design of protease-resistant peptide ligands for the purification of antibodies from human plasma. Journal of Chromatography A. 1445, 93-104 (2016).
- Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , 1-7 (2019).
