コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定のためのウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析の使用

手、足、口の病気(HFMD)は、幼児におけるコクサッキーウイルスA16(CVA16)およびエンテロウイルス71(EV71)によって最も一般的に引き起こされる疾患である。最近、アジア太平洋地域では、CVA16誘発HFMDが著しい上昇を見せております。症状は軽度であり、脳と心臓に影響を与える重篤な合併症が起こり、潜在的な死亡^{事故は1、2}である。現在のところ、CVA16に対して認可された抗ウイルス療法やワクチン接種は存在しないため、将来の流行とそれに関連する合併症を抑制するための抗ウイルス戦略を開発する必要があります。

CVA16は、それぞれVP1、VP2、VP3、およびVP4という4つの構造タンパク質を含むペンタマーから組み立てられたイコサヘドラルドカプシドを持つ非エンベロープウイルスです。ペンタマーの各5倍軸を囲むは、うつ病として示す「キャニオン」領域であり、受容体^結合3におけるその役割で知られている。この渓谷の底部には、スフィンゴシン(SPH)という名前の天然脂肪リガンドを含むVP1領域に疎水性ポケットがあります。ヒトPセレクチン糖タンパク質リガンド1(PSGL-1)およびスカベンジャー受容体クラスB部材2(SCARB2)などの細胞受容体は、このリガンドを置換することによりウイルス結合の役割を果たさなことが示唆されており、その結果、カプシドおよびコプレジドに対する立体構造変化をもたらす。宿主細胞4、5、6へのウイルスゲノムのその後^の排出。ウイルス入力プロセスにおける連続的な事象をブロックする可能性のある阻害剤を同定することは、CVA16感染に対する潜在的な治療戦略を提供する可能性がある。

ウイルスライフサイクルのステップは、モード特異的抗ウイルス剤の同定に役立つ標的として実験的アプローチを通じて解剖することができる。薬物添加分析では、ウイルス感染の前に(ウイルス感染前に追加)、エントリー(ウイルス感染に同時に追加)、およびポストエントリー(以下に追加される)を含む、ウイルス感染中の異なる時期における薬物治療効果を調べる。ウイルス感染)⁷.その影響は、各治療条件で形成されたウイルスプラークの数を定量することにより、標準的なプラークアッセイを用いて評価することができる。フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイは、薬物が宿主細胞へのウイルスの付着を防ぐかどうかを決定する。これは、ヒトウイルス感染の大部分が発生する37°Cから、ウイルスが宿主細胞表面に結合できるが^細胞7に入ることができない4°Cに温度をシフトすることによって達成される。細胞膜結合ウイルス粒子は、ウイルス抗原に対する免疫染色を通じて定量化され、フローサイトメトリーによって評価される。一方、ウイルス不活性化アッセイは、遊離ウイルス粒子との薬物の潜在的な物理的相互作用を評価するのに役立ちます, バイリオンを保護または中和, またはそれらのために非アクティブにする集約や立体構造変化を引き起こす感染8、9の間に宿主細胞表面とのその後の相互作用。この実験では、ウイルス接種は、宿主細胞単層に感染し、標準的なプラークアッセイ8を行う前に薬物をチレートする前に、薬物で最初にインキュベートすることを許可する。最後に、分子ドッキングは、計算を使用して、エンベロープされたウイルスからのウイルス糖タンパク質や非エンベロープウイルスからのウイルスカプシドタンパク質を含む、ビリオン表面上の潜在的な薬物相互作用部位を予測するための強力なツールです。アルゴリズム。これは、薬物の作用モードの標的を機械的に特定し、下流アッセイによってさらに検証できる有用な情報を提供するのに役立ちます。

我々は最近、非エンベロープCVA16⁹による感染を効率的にブロックした抗ウイルス化合物を同定するために、上記の方法を採用した。本明細書において、使用された詳細なプロトコルについて説明し、議論する。