Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии
Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы показать, как использовать латетную световую микроскопию для четырехмерной визуализации динамики поверхностных рецепторов в живых клетках. Здесь показаны Т-клеточные рецепторы на CD4и первичных Т-клетках.
Abstract
Сигнализация и функция клетки диктуются динамическими структурами и взаимодействиями ее поверхностных рецепторов. Чтобы по-настоящему понять структурно-функциональную связь этих рецепторов на месте, нам нужно визуализировать и отслеживать их на поверхности живой клетки с достаточным пространственно-временное разрешение. Здесь мы покажем, как использовать недавно разработанную решетку светолистной микроскопии (LLSM) для изображения Т-клеточных рецепторов (TCRs) четырехмерно (4D, пространство и время) на мембране живых клеток. Т-клетки являются одним из основных эффекторов клеток адаптивной иммунной системы, и здесь мы использовали Т-клетки в качестве примера, чтобы показать, что сигнализация и функция этих клеток обусловлены динамикой и взаимодействия ТКК. LLSM позволяет 4D-изображения с беспрецедентным пространственно-временное разрешение. Этот метод микроскопии поэтому может быть обычно применяется к широкому спектру поверхностных или внутриклеточных молекул различных клеток в биологии.
Introduction
Точная динамика торговли молекулами и распространения на трехмерной поверхности клеток в режиме реального времени была загадкой для решения. Микроскопия всегда была балансом скорости, чувствительности и разрешения; если один или два максимизированы, третий сводится к минимуму. Поэтому из-за небольшого размера и огромной скорости, с которой движутся поверхностные рецепторы, отслеживание их динамики остается серьезной технологической проблемой в области клеточной биологии. Например, многие исследования были проведены с использованием общей внутренней флуоресценции (TIRF) микроскопии1,2 ,3,который имеет высокое временное разрешение, но может только изображение очень тонкий кусочек Мембраны Т-клеток (100 нм), и, следовательно, пропускает события, происходящие дальше в клетке. Эти изображения TIRF также показывают только двумерную часть ячейки. В отличие от этого, супер-разрешение методов, таких как стохастические оптической реконструкции микроскопии (STORM)4, фотоактивированной микроскопии локализации (PALM)5, и стимулировали истощение выбросов микроскопии (STED)6, может преодолеть предел дифракции аббата света. Эти методы имеют высокое пространственное разрешение (разрешение 20 нм)4,5,6,7, но они часто занимают много минут, чтобы приобрести полное двумерное (2D) или трехмерное (3D) изображение, и поэтому временное разрешение теряется. Кроме того, такие методы, как STORM и PALM, которые полагаются на мигающие сигналы могут иметь неточности в подсчете8,9. Электронная микроскопия имеет на сегодняшний день самое высокое разрешение (до 50 вечера резолюции)10; она может быть даже проведена трехмерно с целенаправленной ионного луча сканирования электронной микроскопии (FIB-SEM), в результате чего до 3 нм XY и 500 нм с разрешением11. Тем не менее, любая форма электронной микроскопии требует жесткой подготовки образца и может быть проведена только с фиксированными клетками или тканями, исключая возможность визуализации живых образцов с течением времени.
Методы получения высокого пространственно-временного разрешения, необходимые для определения динамики поверхностных и внутриклеточных молекул в живых клетках в их истинной физиологической 3D природе, только недавно разрабатываются. Одним из таких методов является решетка световой лист микроскопии (LLSM)12, который использует структурированный световой лист, чтобы резко снизить фотоотбеление. Разработанный в 2014 году лауреатом Нобелевской премии Эриком Бетзигом, высокое осевое разрешение, низкое фотоотбеление и фоновый шум, а также способность одновременно изображения сотен самолетов на поле зрения делают микроскопы LLS превосходящими широкоугольные, TIRF и конфокальные микроскопы12,13,14,15,16,17,18,19. Этот четырехмерный (x, y, z и time) метод визуализации, в то же время дифракция ограничена (разрешение XY) в 200 нм, имеет невероятное временное разрешение (мы достигли частоты кадров около 100 кадров в секунду, в результате чего 3D реконструированное изображение ячейки с 0,85 секунды на кадр) для 3D пространственного приобретения.
LLSM обычно используется для отслеживания динамики в реальном времени любых молекул в любой клетке на одномолекуляционном и одноклеточном уровне, особенно в высокомотыльных клетках, таких как иммунные клетки. Например, мы показываем здесь, как использовать LLSM для визуализации динамики Т-клеточных рецепторов (TCR). Т-клетки являются эффекторными клетками адаптивной иммунной системы. TCRs отвечают за распознавание лигандов пептида-MHC (pMHC), отображаемых на поверхности антиген-представляющих клеток (APC), который определяет отбор, развитие, дифференциацию, судьбу и функцию Т-клетки. Это признание происходит на стыке Т-клеток и БТР, в результате чего локализованные кластеризации рецепторов, чтобы сформировать то, что называется иммунологического синапса. Хотя известно, что ТЦР в иммунологическом синапсе необходимы для функции Т-клеточного эффектора, до сих пор неизвестны основные механизмы оборота ТКР в реальном времени в синапсе. LLSM позволилнам визуализировать в режиме реального времени динамику ТЦР до и после оборота в синапс с результирующей pMHC-TCR взаимодействия (Рисунок 1). LLSM поэтому может быть использован для решения текущих вопросов формирующей динамики TCRs и обеспечить понимание того, как клетка различает себя и иностранных антигенов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол был оптимизирован для использования CD4и Т-клеток, изолированных от 5C. C7 трансгенных мышей на используемом инструменте LLSM, и поэтому другие клеточные системы и LLSMs, возможно, должны быть оптимизированы по-разному. Тем не менее, этот протокол показывает силу 4…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить советы и рекомендации доктора Витаса Биндокаса из Чикагского университета. Мы благодарим комплексную световую микроскопию ВШЭ в Чикагском университете за поддержку и поддержание латисового светового листового микроскопа. Эта работа была поддержана NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 и NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. поддерживается Программой стипендий для аспирантов NSF.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
Referências
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
