格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究
Summary
このプロトコルの目的は、ラティス光シート顕微鏡を使用して、生細胞の表面受容体ダイナミクスを4次元的に可視化する方法を示すことを目的としています。ここで、CD4+一次T細胞上のT細胞受容体が示されている。
Abstract
細胞のシグナル伝達と機能は、その表面受容体の動的構造および相互作用によって決定される。これらの受容体の構造と機能の関係を実際に理解するには、十分な時空間分解能で生きた細胞表面上でそれらを視覚化し、追跡する必要があります。ここでは、最近開発したラティス光シート顕微鏡(LLSM)を使用して、生細胞膜でT細胞受容体(TCR)を4次元(4D、空間、時間)で画像化する方法を示します。T細胞は適応免疫系の主要なエフェクター細胞の一つであり、ここではT細胞のシグナル伝達および機能がTCRの動態および相互作用によって駆動されることを示す例としてT細胞を使用した。LLSMは、前例のない時空間分解能で4Dイメージングを可能にします。したがって、この顕微鏡技術は、生物学において異なる細胞の表面または細胞内分子の広い配列に一般的に適用することができる。
Introduction
リアルタイムで3次元細胞表面に人身売買し、拡散する分子の正確なダイナミクスは、解決するための謎でした。顕微鏡は常に速度、感度、および分解能のバランスをとってきました。1 つまたは 2 つが最大化されている場合、3 つ目は最小化されます。したがって、表面受容体が移動する小型および膨大な速度のために、そのダイナミクスを追跡することは、細胞生物学の分野における大きな技術的課題であり続けています。例えば、多くの研究は、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡1、2、3を用いて行われ、時間分解能は高いが、T細胞膜の非常に薄いスライス(約100nm)しか画像化できないため、細胞内で遠くに起こる事象を見逃す。これらのTIRF画像はまた、細胞の2次元断面のみを示す。対照的に、ストカスティック光学再構成顕微鏡(STORM)4、光活性化局在顕微鏡(PALM)5、刺激発光枯渇顕微鏡(STED)6などの超解像技術は、光のアッベ回折限界を克服できる。これらの技術は、高い空間分解能(~20 nmの解像度)4、5、6、7を有するが、それらは多くの場合、完全な2次元(2D)または3次元(3D)画像を取得するために、時間分解能が失われる。さらに、点滅する信号に依存するSTORMやPALMなどの技術は、カウント8、9に不正確を持つ可能性があります。電子顕微鏡法は、はるかに最高の解像度(最大50 pm解像度)10を有する。集積イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)で3次元的に行うことさえでき、最大3nm XYおよび500nmZ分解能11を生じる。しかし、電子顕微鏡の任意の形態は、過酷なサンプル調製を必要とし、時間をかけてライブサンプルをイメージングする可能性を排除し、固定細胞または組織でのみ行うことができます。
真の生理的3Dの性質において、生細胞における表面および細胞内分子のダイナミクスを同定するために必要な高い時空間分解能を得るための技術は、最近開発されたばかりです。その一つがラティス光シート顕微鏡(LLSM)12で、構造型ライトシートを利用して光の漂白を大幅に低減する。ノーベル賞受賞者エリック・ベツィヒによって2014年に開発され、高軸解像度、低いフォトブリーチングとバックグラウンドノイズ、および視野ごとに数百の平面を同時に画像化する能力は、LLS顕微鏡を広視野、TIRFおよび共焦点顕微鏡12、13、14、15、16、17、19に優れています。この4次元(x、y、zおよび時間)イメージング技術は、まだ回折が限られている(約200 nm XYZ解像度)、3D空間取得のための信じられないほどの時間分解能(約100fpsのフレームレートを達成し、フレームあたり0.85秒の3D再構築された細胞像をもたらす)を有する。
LLSMは、一般に、単一分子および単一細胞レベル、特に免疫細胞のような高い可動細胞における任意の細胞内の任意の分子のリアルタイムダイナミクスを追跡するために使用することができる。例えば、ここではLLSMを使用してT細胞受容体(TCR)ダイナミクスを視覚化する方法を示します。T細胞は、適応免疫系のエフェクター細胞である。TCは、抗原提示細胞(APC)の表面に表示されるペプチドMHC(pMHC)リガンドを認識し、T細胞の選択、発達、分化、運命、機能を決定します。この認識は、T細胞とAPCの界面で起こり、局所的な受容体クラスタリングが免疫学的シナプスと呼ばれるものを形成する。免疫シナプスのTCRはT細胞エフェクター機能に不可欠であると知られているが、シナプスへのリアルタイムTCR人身売買の根本的なメカニズムはまだ不明である。LLSM は、結果として得られた pMHC-TCR インタラクションを使用して、シナプスへの入稿の前後に TCR のダイナミクスをリアルタイムで視覚化することを可能にしました (図 1)。LLSMは、TCの形成力学の現在の問題を解決し、細胞が自己抗原と外来抗原をどのように区別するかを理解するための洞察を提供するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルは、5Cから分離されたCD4+ T細胞の使用に最適化された。使用されるLLSM機器上のC7トランスジェニックマウス、したがって他の細胞システムとLLSMは異なる方法で最適化する必要があるかもしれません。しかし、このプロトコルは、生理学的条件下で最も歪みが少ない細胞全体の表面受容体のダイナミクスを定量化するために使用することができるため、4Dイメージ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
シカゴ大学のヴィタス・ビンドカス博士からの助言と指導を受け、お知りしたいと思います。私たちは、格子光シート顕微鏡をサポートし、維持するためにシカゴ大学の統合光顕微鏡コア施設に感謝します。この作品は、NIH新イノベーター賞1DP2AI144245とNSFキャリアアワード1653782(To J.H.)によってサポートされました。J.R.は、NSF大学院研究フェローシッププログラムの支援を受けています。
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
Referências
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
