Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet per visualizzare in modo quadridimensionale le dinamiche del recettore superficiale nelle cellule vive. Qui vengono mostrati i recettori delle cellule T su CD4– cellule T primarie.
Abstract
La segnalazione e la funzione di una cellula sono dettate dalle strutture dinamiche e dalle interazioni dei suoi recettori superficiali. Per comprendere veramente la relazione struttura-funzione di questi recettori in situ, dobbiamo visualizzarli e tracciarli sulla superficie della cellula viva con una risoluzione spatiotemporale sufficiente. Qui mostriamo come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet (LLSM) recentemente sviluppata per immagini di recettori delle cellule T (TCR) in quarta dimensione (4D, spazio e tempo) alla membrana cellulare attiva. Le cellule T sono una delle principali cellule efcomeotrici del sistema immunitario adattivo, e qui abbiamo usato le cellule T come esempio per dimostrare che la segnalazione e la funzione di queste cellule sono guidate dalle dinamiche e dalle interazioni dei TCR. LLSM consente l’imaging 4D con una risoluzione spatiotemporale senza precedenti. Questa tecnica di microscopia può quindi essere generalmente applicata a una vasta gamma di molecole superficiali o intracellulari di cellule diverse in biologia.
Introduction
La dinamica precisa del traffico e della diffazione delle molecole sulla superficie cellulare tridimensionale in tempo reale è stata un enigma da risolvere. La microscopia è sempre stata un equilibrio di velocità, sensibilità e risoluzione; se uno o due sono ingranditi, il terzo viene ridotto a icona. Pertanto, a causa delle piccole dimensioni e dell’immensa velocità con cui i recettori di superficie si muovono, il monitoraggio delle loro dinamiche è rimasto una grande sfida tecnologica per il campo della biologia cellulare. Ad esempio, molti studi sono stati condotti utilizzando la microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF)1,2,3, che ha un’alta risoluzione temporale, ma può solo immaginare una fetta molto sottile della membrana a T-cell (100 nm), e quindi manca eventi che accadono più lontano nella cella. Queste immagini TIRF mostrano anche solo una sezione bidimensionale della cella. Al contrario, le tecniche di super-risoluzione, come la microscopia stocastica della ricostruzione ottica (STORM)4, la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)5e la microscopia stimolata all’esaurimento delle emissioni (STED)6,possono superare il limite di diffrazione di Abbe della luce. Queste tecniche hanno un’elevata risoluzione spaziale (risoluzione di 20 nm)4,5,6,7, ma spesso richiedono molti minuti per acquisire un’immagine bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) completa e pertanto la risoluzione temporale viene persa. Inoltre, tecniche come STORM e PALM che si basano su segnali lampeggianti possono avere imprecisioni nel conteggio8,9. La microscopia elettronica ha di gran lunga la risoluzione più alta (fino a risoluzione fino alle 17)10; può anche essere condotta tridimensionalmente con la microscopia elettronica a scansione del fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), con conseguente fino a 3 nm XY e 500 nm – risoluzione11. Tuttavia, qualsiasi forma di microscopia elettronica richiede una dura preparazione dei campioni e può essere condotta solo con cellule o tessuti fissi, eliminando la possibilità di imaging di campioni vivi nel tempo.
Le tecniche per ottenere l’alta risoluzione spatiotemporale necessaria per identificare la dinamica delle molecole superficiali e intracellulari nelle cellule vive nella loro vera natura 3D fisiologica sono state sviluppate solo di recente. Una di queste tecniche è Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, che utilizza un foglio luminoso strutturato per ridurre drasticamente il fotobleaching. Sviluppato nel 2014 dal premio Nobel Eric Betzig, l’alta risoluzione assiale, il basso fotosbiancamento e il rumore di fondo, e la capacità di visualizzare contemporaneamente centinaia di piani per campo visivo rendono i microscopi LLS superiori ai microscopi widefield, TIRF e confocal e confocal e confocal12,13,14,15,16,17,18. Questa tecnica di imaging quadridimensionale (x, y, z e time), mentre ancora la diffrazione limitata (risoluzione XYz da 200 nm) ha un’incredibile risoluzione temporale (abbiamo raggiunto una frequenza fotogrammi di circa 100 fps, con un’immagine cellulare ricostruita 3D con 0,85 secondi per fotogramma) per l’acquisizione spaziale 3D.
Il LLSM può essere generalmente utilizzato per monitorare la dinamica in tempo reale di qualsiasi molecola all’interno di qualsiasi cellula a livello di singola molecola e singola cellula, in particolare quelle nelle cellule altamente motili come le cellule immunitarie. Ad esempio, qui mostriamo come utilizzare LLSM per visualizzare le dinamiche del recettore delle cellule T (TCR). Le cellule T sono le cellule efsiate del sistema immunitario adattivo. I TCR sono responsabili del riconoscimento dei ligandi peptide-MHC (pMHC) visualizzati sulla superficie delle cellule che presentano l’antigene (APC), che determina la selezione, lo sviluppo, la differenziazione, il destino e la funzione di una cellula T. Questo riconoscimento si verifica nell’interfaccia tra le cellule T e gli APC, con conseguente clustering del recettore localizzato per formare quella che viene chiamata sinapsi immunologica. Mentre è noto che i TCR nella sinapsi immunologica sono imperativi per la funzione dell’effettore delle cellule T, ancora sconosciuti sono i meccanismi sottostanti del traffico di TCR in tempo reale verso la sinapsi. LLSM ci ha permesso di visualizzare in tempo reale le dinamiche dei TCR prima e dopo il traffico verso la sinapsi con la conseguente interazione pMHC-TCR (Figura 1). Il LLSM può quindi essere utilizzato per risolvere le attuali questioni delle dinamiche formative delle TCR e fornire informazioni per capire come una cellula distingue tra antigeni auto ed estranei.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato è stato ottimizzato per l’utilizzo di cellule CD4– T isolate da 5C. I topi transgenici C7 sullo strumento LLSM utilizzati, e quindi altri sistemi cellulari e LLSM potrebbero dover essere ottimizzati in modo diverso. Tuttavia, questo protocollo mostra la potenza dell’imaging 4D, in quanto può essere utilizzato per quantificare la dinamica di un recettore superficiale su un’intera cellula con la minima distorsione in condizioni fisiologiche. Pertanto, ci sono molte possibili applicazio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere i consigli e la guida del Dr. Vytas Bindokas presso l’Università di Chicago. Ringraziamo l’Integrated Light Microscopy Core Facility dell’Università di Chicago per aver sostenuto e mantenuto il microscopio a fogli luminosi a reticolo. Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e dal NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. è supportato dal NSF Graduate Research Fellowships Program.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
Referências
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