فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا
Summary
يتم تقديم بروتوكول مفصل لتوليد ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا لفحص مثبطات كيناز.
Abstract
فحص مثبطات كيناز أمر حاسم لتحسين فهم خصائص المخدرات وتحديد الأهداف المحتملة الجديدة مع الآثار السريرية. وتم الإبلاغ عن عده منهجيات لإنجاز هذا الفحص. ومع ذلك ، كل له القيود الخاصة به (علي سبيل المثال ، فحص نظائرها ATP فقط ، وتقييد استخدام المجالات المنقية كيناز ، والتكاليف الكبيرة المرتبطة باختبار أكثر من عدد قليل من تحركات في وقت واحد ، وعدم وجود مرونة في فحص البروتين تحركات مع طفرات جديده). هنا ، يتم عرض بروتوكول جديد يتغلب علي بعض من هذه القيود ويمكن استخدامها لفحص غير متحيز لمثبطات كيناز. قوه هذه الطريقة هي قدرتها علي مقارنه نشاط مثبطات كيناز عبر العديد من البروتينات ، اما بين الانزيمات المختلفة أو المتغيرات المختلفة لنفس كيناز. وتستخدم المصفوفات المجهرية للبروتين التي يتم تجميعها ذاتيا والمتولدة من خلال التعبير عن البروتينات التي يقوم بها نظام النسخ والترجمة القائم علي الإنسان في المختبر (IVTT). البروتينات المعروضة علي ميكرواري نشطه ، مما يسمح لقياس اثار مثبطات كيناز. يصف الاجراء التالي خطوات البروتوكول بالتفصيل ، من توليد ميكروصفيف والفرز إلى تحليل البيانات.
Introduction
كيناسيس البروتين هي المسؤولة عن فوسفولات من أهدافها ، ويمكن ان تعدل المسارات الجزيئية المعقدة التي تتحكم في العديد من الوظائف الخلوية (اي انتشار الخلايا ، والتمايز ، وموت الخلايا والبقاء علي قيد الحياة). ويرتبط تحرير نشاط كيناز مع أكثر من 400 الامراض ، مما يجعل مثبطات كيناز واحده من الفئات الرئيسية من الادويه المتاحة لعلاج العديد من الامراض ، بما في ذلك السرطان والقلب والاوعيه الدموية والاضطرابات العصبية وكذلك التهابات وامراض المناعة الذاتية1،2،3.
مع ظهور الطب الدقيق ، وتحديد العلاجات الجديدة ، وخاصه مثبطات كيناز ، لديها نداء كبير صيدليا وسريريا. ويمكن استخدام العديد من النهج لتحديد أزواج جديده ممكنة من مثبطات كيناز/كيناز ، بما في ذلك تصميم دي نوفو من مثبطات كيناز وتحديد أهداف جديده للادويه القائمة المعتمدة من قبل هيئه الاغذيه والعقاقير. هذه الاخيره جذابة بشكل خاص ، حيث ان الوقت والمال اللازم لتنفيذ هذه الادويه في العيادات تنخفض بشكل كبير بسبب توافر بيانات التجارب السريرية السابقة. والمثال المتعارف عليه لأعاده الغرض من مثبطات كيناز هو imatinib ، المصممة في البداية لعلاج ابيضاض الدم النقوي المزمن (CML) من خلال تثبيط BCR-Abl ، والتي يمكن أيضا ان تستخدم بنجاح لعلاج الإفراط في التعبير c-كيت أورام الأمعاء اللحمية (العلماء)4،5،6،7.
يمكن اجراء فحص مثبطات كيناز في اختبارات ملزمه أو المقايسات القائمة علي الانزيميه. تركز الدرجة الاولي من المقايسات علي تفاعلات البروتين والدواء ويمكن ان توفر معلومات مثل موقع الربط والتقارب. منذ نشاط كيناز في وقت هذه الاختبارات غير معروف ، يمكن تفويتها عدد من التفاعلات أو تحديدها زورا بسبب التغيرات المطابقة في البروتين. ومن ناحية أخرى ، تتطلب المقايسات القائمة علي الانزيميه ان تكون البروتينات البروتينية نشطه وتوفر معلومات قيمه فيما يتعلق بتاثير المثبط علي نشاط الانزيم ، ومع ذلك ، فان هذا النوع من الفحص هو عموما أكثر استهلاكا للوقت ومكلفا. حاليا ، كلا النوعين من المقايسات متاحه تجاريا من عده مصادر. انها تمثل خيارا موثوقا للكشف عن مثبطات كيناز مع بعض القيود, بما في ذلك: I) معظم الطرق تنطوي علي اختبار الانزيمات المتعددة بشكل فردي, التي يمكن ان تجعل من فحص مجموعه كبيره من البروتينات مكلفه; II) تقتصر مجموعه من الانزيمات التي سيتم اختبارها علي قائمه من النوع الذي تم اختياره مسبقا ، والأنواع البرية ، والعديد من الإصدارات المتحولة المعروفة لبعض الانزيمات ، مما يعوق اختبار العديد من الاشكال الجديدة المتحولة.
وفي هذا السياق ، فان ميكروصفائف البروتين هي منصة قويه قادره علي التغلب علي بعض القيود التي تقدمها التقنيات المتاحة تجاريا. وهي مناسبه لاجراء اختبارات الانزيميه في الفحص عاليه الانتاجيه باستخدام كامل الطول ، والبروتينات النشطة من اي تسلسل الفائدة. يمكن ان تتولد ميكروصفائف من قبل نهج تجميعها ذاتيا مثل نابا (الحمض النووي مصفوفة بروتين قابل للبرمجة) ، والتي يتم التعبير عن البروتينات في الوقت المناسب لاختبارات ، مما يزيد من احتمال ان تلك المعروضة علي الصفيف هي في الواقع نشطه. يتم إنتاج البروتينات المعروضة علي نابا باستخدام التماثيل البشرية المشتقة والبروتينات المرافقة من أجل تحسين احتمال الطي الطبيعي والنشاط.
يتم برمجه البروتينات في البداية عن طريق الطباعة cdnas الترميز للجينات من الفائدة تنصهر مع علامة التقاط ، مع وكيل القبض ، علي سطح ميكرواري. ثم يتم إنتاج البروتينات علي ميكروصفائف باستخدام نظام النسخ والترجمة في المختبر (ivtt) ، ويتم تعبئة البروتينات المعرب عنها حديثا علي سطح ميكروارس من قبل وكيل القبض. ويمكن استخدام صفائف نابا المعرب عنها لدراسة البروتينات المعروضة علي الصفيف بطريقه غير متحيزة ، عاليه الانتاجيه8،9.
سابقا ، تبين ان البروتينات المعروضة علي صفائف نابا مطوية بشكل صحيح للتفاعل مع الشركاء المعروفين10؛ وعلاوة علي ذلك, تم استغلال النشاط الانزيمي لأول مره في 2018, عندما تبين ان البروتين كيناسيس عرض علي ميكروصفيف اوتوفوسفروفات11. حتى الآن ، تم استخدام منهجيه نابا للعديد من التطبيقات المتميزة ، بما في ذلك اكتشاف المؤشرات البيولوجية12،13،14،15،16،17، البروتين البروتين التفاعلات10،18، الركيزة تحديد19، وفحص المخدرات11. وتعد مرونته أحدي الخصائص الرئيسية للمنبر التي تسمح بالتكيف مع كل تطبيق.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص مثبطات التيروزين كيناز في صفائف نابا تجميعها ذاتيا. تم تحسين المنصة لعرض البروتين البشري النشط ولتحليل نشاط بروتين كيناز ، مع خلفيه منخفضه ونطاق ديناميكي عالي. ومن بين التعديلات التي تم تنفيذها لاستخدام نابا لفحص مثبطات كيناز ما يلي: انا) التغييرات في كيمياء الطباعة ، II) دي فوسفوريلاتيون من البروتين ميكروصفيف قبل فحص مثبطات كيناز ، و III) الأمثل للكشف عن البروتينات الفوسفوليه علي الصفيف. هذا البروتوكول هو الأول من نوعه ويوفر معلومات فريدة عن دراسة كيناز في ميكروصفائف نابا.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
وخلال مرحله التحسين في دراسة نشاط كيناز علي صفائف نابا ، كان أحد المصادر الرئيسية للخلفية والمدى الديناميكي المنخفض الذي لوحظ هو جيش صرب الجمهورية المستخدم في مزيج الطباعة. وكان الجيش الصربي البوسني يوفر الأمينات الاساسيه اللازمة للربط مع سطح امينوسيليكات وكان محاصره الحمض النووي والأجسام المضادة للقبض علي الفور. ومع ذلك ، فان الجيش الصربي البوسني هو الفوسفارلاتيد للغاية ، مما يجعل من الصعب للكشف عن اشاره اوتوفوسفرويليشن علي الصفيف فوق الضوضاء الخلفية. ولحل هذه المشكلة ، تم اختبار عده بدائل للجيش الصربي البوسني في مزيج الطباعة ، وتم تحديد بولي-ليسين كبديل جيد. بولي-يسين يفتقر إلى اي موقع فوسفرويليشن; لذلك ، الخلفية من صفائف غير المعرب عنها الحد الأدنى جدا. وعلاوة علي ذلك ، ميكروصفائف المطبوعة مع بولي يسين هي استنساخه وعرض مستويات جيده من البروتينات (الشكل 2).
وكان التعديل الحاسم التالي الذي اجري علي فحص نابا القياسية أضافه خطوه العلاج الفوسفاتيز/DNase. العلاج من ميكروصفائف مع الفوسفاتيز يسمح بازاله اي فوسفولات التي وقعت في مزيج IVTT اثناء تخليق البروتين والقبض (الشكل 3). مصدر هذا فوسفولات يمكن ان يكون من النشاط اوتوفوسفروسيليشن الذاتية أو من نشاط كيناسيس الموجودة في مزيج IVTT. وقد سمح أزاله جميع الفوسفات بعد التعبير بسهوله التعرف علي الانزيمات النشطة والتي يمكن الخضوع لها (الشكل 3).
الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول
نابا هي تقنيه قويه ، ولكن كما هو متوقع ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة. الأول هو الحصول علي الحمض النووي عاليه الجودة في التركيز المناسب. استخدام الحمض النووي من نوعيه رديئه أو في تركيزات منخفضه سوف تولد ميكروصفائف نوعيه رديئه مع العديد من الميزات التي لا يتم التعبير عنها وعرضها في المستويات المناسبة ، وخفض عدد البروتينات تحليلها علي الصفيف. الخطوة الحاسمة الثانية هي التعبير عن البروتينات علي ميكروصفيف. استخدام نظام IVTT التي من شانها ان تعبر عن مستويات عاليه من البروتين الوظيفي أمر حيوي لدراسة نشاط كيناز علي الصفيف.
والخطوة الحاسمة التالية في فحص TKI هي كيفيه معالجه المصفوفات المجهرية. يجب ان لا تجف ميكروصفائف اثناء اي خطوه من البروتوكول ، وينصح التعامل مع لطيف لمنع الخدوش التي يمكن ان تزيد من اشاره الخلفية. نظرا لان صفائف من التجربة بأكملها ستقارن ضد بعضها البعض ، فمن المهم ان أؤكد ان كل خطوه الحضانة حتى عبر جميع الشرائح. علي سبيل المثال ، الوقت المطلوب لتنفيذ خطوه واحده في صفيف واحد يجب ان يؤخذ في الاعتبار عند معالجه دفعه من 20 صفائف لمنع الاختلافات في طول الحضانة عبر الصفائف.
وأخيرا ، فان تصميم التجربة وادراج كل من الضوابط الايجابيه والسلبية أمران بالغا الاهميه لمراقبه الجودة وتحليل البيانات. المجموعة الاولي من عناصر التحكم هي تلك التي تطبع في كل صفيف وتشمل الضوابط السلبية [اي ، البقع الفارغة (دون اي ماده مطبوعه) ، الماء أو ناقل فارغ (التعبير عن العلامة فقط)] ، فضلا عن السيطرة الايجابيه (اي ، مفتش المنقي ، التي يتم الكشف عنها من قبل الأجسام المضادة الثانوية وخاملة للتغيير في مستويات فوسفولات). بشكل جماعي ، فانها تقيس مستويات الخلفية من ميكروصفيف ، يمكن ترحيلها اثناء الطباعة وكثافة اشاره من طريقه الكشف.
والمجموعة التالية من عناصر التحكم هي ضوابط فحص المخدرات وتشمل المصفوفات المجهرية الفوسفاتية والفوسفروكسيلاتيد (في وجود أو غياب DMSO). وكما ذكر في وقت سابق ، يقيس ميكروصفيف ديفوسفوريلاتيد مستوي الفوسفاريليشن بعد العلاج الفوسفاتيز التالي مستوي خط الأساس لجميع التجارب الأخرى. ال [لوور] الخط أساسي مستوي, ال [هيغر] المدى حركيه من الاختبارات. المصفوفات التلقائية التي تقدم الحد الأقصى لمستويات فوسفولات من جميع صفائف ويجب ان تكون الاشاره قويه وواضحة. يتم استخدامه لتحليل البيانات ، ولكن أيضا كعنصر تحكم ان يتم تنفيذ كافة ردود الفعل بنجاح علي الصفيف.
قيود التقنية
اعتبارا من الآن ، واحده من القيود المفروضة علي الكشف عن المخدرات المعروضة هنا هو قدرته علي الشاشة فقط كيناسيس البروتين التي يمكن ان تكون اوتوفوسفوليلتيد. واحده من الطرق الممكنة للتغلب علي هذا هو طباعه كيناز والركيزة المعروفة في نفس المكان. وتم بنجاح إنجاز الطباعة المشتركة للحمضالنووي لاثنين من البروتينات المتميزة ، مما يوحي بجدوى هذا النهج. وعلاوة علي ذلك ، قد لا يتم طي البروتين المعروض علي الصفيف بشكل صحيح مما يؤدي إلى وجود بروتين غير نشط. وقد حقق استخدام نظام التعبير القائم علي الإنسان تحسنا كبيرا في نشاط كيناز مقيسا بالمصفوفة ؛ ومع ذلك ، لا يزال لا يمكن تحليل بعض البروتينات علي الصفيف بسبب عدم نشاطها.
والقيد الثاني هو قياس الفوسفات باستخدام الأجسام المضادة لعموم فوسفس-صور. وعلي الرغم من عدم الخصوصية المتعلقة بالفكرة الخاصة بموقع الفوفوفورلات ، فقد حدثت جميع فوسفولات القياس علي بقايا تيروزين ، تاركه وراءها المصليين والثلاثات والانزيمات الخاصة بهم. حتى الآن ، تم اختبار أكثر من 10 الأجسام المضادة لعموم الفوسفاو-سر/Thr دون نجاح ، علي الرغم من عده محاولات لتحسين الحضانة وظروف الغسيل. نظام الكشف الجديد الذي هو مستقل عن الأجسام المضادة قد يكون الخيار الأفضل لتوسيع عدد البروتينات التي يمكن فحصها لتثبيط المخدرات. في هذا السياق ، تتوفر بعض الخيارات بما في ذلك النشاط الإشعاعي أو النهج الكيميائية مثل الاقتران بالنقر. وهناك حاجه إلى سلسله من التحسينات للتقليل من اشاره الخلفية وتوفير مجموعه ديناميكية جيده لمقايسات.
القيد الثالث هو الحصول علي استنساخ cDNA ليتم طباعتها علي الصفيف. يمكن إنشاء استنساخ cDNA باستخدام اي تقنيه الاستنساخ بما في ذلك أنظمه أعاده التركيب الخاصة بالموقع ، مثل منشئ أو بوابه23. خيار آخر هو شراء المستنسخين من مكتبه دناس ، وجدت في ، حيث أكثر من 17,000 cDNAs المستنسخة ، بما في ذلك kinome البشرية بأكملها ، متاحه بسهوله لاستخدامها لبناء نابا صفائف24 .
والقيد الرابع هو انه ليس كل مختبر مجهز بالمعدات المناسبة لتلفيق وفرز صفائف نابا الخاصة بهم. يوفر هذا البروتوكول أساليب بديله لتوليد الحمض النووي للطباعة علي ميكروصفيف ، دون الحاجة إلى معدات عاليه الانتاجيه ، وبروتوكولات لتنفيذ جميع الخطوات التهجين يدويا. ومع ذلك ، لا يزال من الضروري الوصول إلى ماسح ضوئي و ميكروصفيف. أحد الخيارات للتغلب علي هذه المشكلة هو استخدام خدمه ومرفق نابا الاساسيه ، وجدت في ، والتي توزع ميكروصفائف نابا مخصصه بسعر الاكاديميه غير الربحية. وأخيرا ، واعتبارا من اي منهجيه للفحص ، فان البيانات التي يتم الحصول عليها علي صفائف تكون عرضه لان تكون تحفا (اما ايجابيه أو سلبيه) التالي ينبغي التحقق من صحتها باستخدام المقايسات المتعامدة.
الاهميه فيما يتعلق بالأساليب القائمة
العديد من منصات متاحه تجاريا للكشف عن كيناسيس البروتين. نهج واحد يستخدم بشكل روتيني هو اختبارات ملزمه ، والتي يمكن ان تؤدي مع شظايا البروتين ، والمجال كيناز ، وشظايا البروتين أكبر مع المجال كيناز وبعض المناطق التنظيمية ، وحتى البروتينات كامله الطول. وعاده ما يتم التعبير عن البروتينات في النظم البكتيرية بسبب التكلفة والبساطة في بروتوكولات التعبير وتنقيه. ثم يتم قياس التفاعل بين الدواء من الفائدة والبروتين مع نوع من الفحص التقرير مثل مضان أو وجود العلامات ، علي سبيل المثال. القيد الرئيسي لهذه المجموعة من النهج هو حقيقة ان البروتين ليس بالضرورة نشطه اثناء التفاعل مع المخدرات ، والتي قد تؤدي إلى تحديد التفاعلات السلبية الايجابيه والزائفة كاذبه. شظايا البروتين هي عرضه بشكل خاص للتغيرات في التكوين وعدم وجود النشاط وجميع البيانات التي تم الحصول عليها ينبغي التحقق من صحتها باستخدام البروتينات النشطة ، ويفضل في شكلها كامل طول. وهناك قيد آخر علي بعض المنصات هو القدرة علي الشاشة فقط النظير ATP ، والحد من استخدامها الشامل.
معظم الخدمات المتاحة تجاريا لفحص TKIs باستخدام النهج الانزيميه القائمة تستخدم فقط الإصدارات من نوع البرية من كيناز الفائدة ، وأحيانا فقط عدد قليل مختاره من المسوخ. مع العلم ان مقاومه المخدرات شائعه جدا في المرضي الذين يتعاملون مع TKI ، من المهم ان تكون قادره علي قياس الاستجابة للمخدرات في المسوخ مختلفه ، لاختيار المثبط الأكثر ملاءمة. نظرا لطبيعة نابا ، وفحص المسوخ كيناز بسيطه ويمكن إنجازها بسهوله ، والاداه المطلوبة الوحيدة هي دمج متحولة كيناز في مجموعه نابا cDNA ، والتي يمكن القيام به عن طريق الطفرات الخاصة بالموقع ، علي سبيل المثال.
التطبيقات المستقبلية
واحده من الاشكال الأكثر شيوعا من العلاج الذي ينقضي في العلاج بالسرطان باستخدام مثبطات كيناز هو اكتساب الطفرات في الهدف المخدرات خلال دوره العلاج. فحص هذه المسوخ بشان استجابتها لمثبطات كيناز له اهميه حيوية لاختيار الجيل الثاني/الثالث من TKIs لتحقيق العلاج الشخصي لكل مريض. نهج الكشف عن المخدرات المعروضة هنا, يوفر منصة الفرز غير متحيزة التي يمكن اختبار اي مثبطات كيناز التيروزين ضد لوحه من الكيناسيس تيروزين الموجودة في الجينوم البشري. منذ يتم التعبير عن البروتينات المعروضة علي صفائف نابا في المختبر من cDNA المطبوعة علي الشريحة ، اي متغير متحولة يمكن بسهوله ان تدمج في مجموعه cDNA ليتم عرضها علي الصفيف. المنشاة التي يمكن توليد المسوخ كيناز والتعبير عنها علي الصفيف ، جنبا إلى جنب مع قوه عاليه الانتاجيه من تقنيه نابا ، يوفر بيئة فريدة من نوعها لدراسة المسوخ كيناز واستجابتهم للمخدرات ، مما يجعل نابا مناسبه فحص المخدرات شخصيه ، واحده من أهداف الطب الدقة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون ان يشكروا الجميع في مختبر لاباير علي مساعدتهم وانتقادهم اثناء تطوير المشروع. وقد تم دعم هذا المشروع من قبل منحه المعاهد القومية للصحة U01CA117374 ، U01AI077883 ومؤسسه فرجينيا ج. بايبر.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 364 well plates (for arraying) | Genetix | x7020 | |
| 800 µL 96-well collection plate | Abgene | AB-0859 | |
| 96-pin device | Boekel | 140500 | |
| Acetic Acid | Millipore-Sigma | 1.00066 | |
| Acetone 99.9% | Millipore Sigma | 650501 | |
| Aluminum seal for 96 well plates | VWR | 76004-236 | |
| Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) | Pierce | 80370 | |
| ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Millipore Sigma | F3165 | |
| Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) | Millipore Sigma | F7425 | |
| ATP 10 mM | Cell Signaling | 9804S | |
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Millipore-Sigma | G9422 | |
| bacteriological agar | VWR | 97064-336 | |
| Blocking Buffer | ThermoFisher/Pierce | 37535 | |
| Brij 35 | ThermoFisher/Pierce | BP345-500 | |
| BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) | ThermoFisher/Pierce | 21580 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Millipore Sigma | A2153 | |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 48393-106 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | |
| DeepWell Block, case of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0661 | |
| DEPC water | Ambion | 9906 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Millipore-Sigma | D8418 | |
| DNA-intercalating dye | Invitrogen | P11495 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| DTT | Millipore-Sigma | 43816 | |
| EDTA | Millipore-Sigma | EDS | |
| Ethanol 200 proof | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Filter plates | Millipore-Sigma | WHA77002804 | |
| Gas Permeable Seals, box of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0718 | |
| Glass box | Wheaton | 900201 | |
| Glass slides | VWR | 48300-047 | |
| Glycerol | Millipore-Sigma | G5516 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Millipore-Sigma | H1758 | |
| HEPES Buffer Solution | Millipore-Sigma | 83264 | |
| Human-based IVTT system | Thermo Scientific | 88882 | |
| ImmunoPure Mouse IgG whole molecule | ThermoFisher/Pierce | 31202 | |
| Isopropanol | Millipore-Sigma | I9516 | |
| KCl (Potassium chloride) | Millipore-Sigma | P9333 | |
| KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) | Millipore-Sigma | P5655 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling | 9802 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Millipore-Sigma | P1190 | |
| Lambda Protein Phosphatase | new england biolabs | P0753 | |
| Lifterslips, 24 x 60 mm | ThermoFisher Scientific | 25X60I24789001LS | |
| Metal 30-slide rack with no handles | Wheaton | 900234 | |
| MgCL2 (Magnesium chloride) | Millipore-Sigma | M8266 | |
| Na3VO4 (Sodium orthovanadate) | Millipore-Sigma | S6508 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Millipore-Sigma | S3014 | |
| NaOAc (Sodium acetate) | Millipore-Sigma | S2889 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Millipore-Sigma | S8045 | |
| NucleoBond Xtra Midi / Maxi | Macherey-Nagel | 740410.10 / 740414.10 | |
| Nucleoprep Anion II | Macherey Nagel | 740503.1 | |
| Phosphoric Acid | Millipore-Sigma | 79617 | |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | Millipore-Sigma | A-005-C | |
| Protein Phosphatase (Lambda) | New England Biolabs | P0753 | |
| RNAse | Invitrogen | 12091021 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | L6026 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | 05030 | |
| Sealing gasket | Grace Bio-Labs, Inc | 44904 | |
| Silica packets | VWR | 100489-246 | |
| Single well plate | ThermoFisher/Nalge Nunc | 242811 | |
| Sodium acetate (3M, pH 5.5) | Millipore-Sigma | 71196 | |
| TB media (Terrific Broth) | Millipore-Sigma | T0918 | |
| Tris | IBI scientific | IB70144 | |
| Triton X-100 | Millipore-Sigma | T8787 | |
| Tryptone | Millipore-Sigma | T7293 | |
| Tween 20 | Millipore-Sigma | P9416 | |
| Yeast Extract | Millipore-Sigma | Y1625 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipments | Maker/model | ||
| Programmable chilling incubator | Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling | ||
| Shaker for bacterial growth | ATR Multitron shaker | ||
| Vacuum manifold with liquid waste trap | MultiScreenVacuum Manifold 96 well | ||
| 96 well autopippetor/liquid handler | Genmate or Biomek FX | ||
| Liquid dispenser | Wellmate | ||
| DNA microarrayer | Genetix QArray2 | ||
| Automatic hybridization station | Tecan HS4800 Pro Hybridization Station | ||
| Microarray scanner | Tecan PowerScanner | ||
| Microarray data quantification | Tecan Array-ProAnalyzer 6.3 |
Referências
- Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).
- Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).
- Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. FDA-approved small-molecule kinase inhibitors. Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).
- Heinrich, M. C., et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 96 (3), 925-932 (2000).
- Stagno, F., et al. Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes. Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).
- Ben Ami, E., Demetri, G. D. A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor. Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).
- Ramachandran, N., et al. Self-assembling protein microarrays. Science. 305 (5680), 86-90 (2004).
- Festa, F., et al. Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu. Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).
- Rauf, F., et al. Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner. Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).
- Anderson, K. S., et al. Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer. Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).
- Wang, J., et al. Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).
- Bian, X., et al. Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays. Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).
- Song, L., et al. Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).
- Wang, J., et al. Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules. Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).
- Montor, W. R., et al. Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays. Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).
- Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).
- Yu, X., et al. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).
- Anderson, K. S., et al. Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer. Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).
- Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL. Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).
- Smith, M. R. Ibrutinib in B lymphoid malignancies. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).
- Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics. Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).
