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Bioquímica

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

Abstract

이노시톨 인산염과 인산화효소는 진핵생물의 여러 세포 과정을 조절하며, 유전자 발현, 소포 인신매매, 신호 전염, 대사 및 발달을 포함합니다. 이 대사 산물은 단백질에 결합하여 이 규정하는 활동을 능력을 발휘합니다, 그로 단백질 형태, 촉매 활동 및/또는 상호 작용을 변경합니다. 여기에서 기술한 방법은 질량 분광법 또는 서쪽 blotting에 결합된 친화성 크로마토그래피를 사용하여 이노시톨 인산염 또는 인산화물과 상호 작용하는 단백질을 확인합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화물은 화학적으로 비오틴으로 태그가 지정되어 있으며, 이 제품은 아가로오스 또는 자기 구슬에 결합된 스트렙타비딘을 통해 포획됩니다. 단백질은 대사 산물에 결합하는 그들의 친화력에 의해 단리되고, 그 후 질량 분석법 또는 서쪽 얼룩에 의해 용출되고 확인됩니다. 이 방법은 민감하고 비방사성, 리포솜이 없고 사용자 정의 할 수있는 간단한 워크플로우를 가지고 있으며 단백질 및 대사 산물 상호 작용의 정밀도 분석을 지원합니다. 이 접근법은 복잡한 생물학적 샘플에서 단백질 대사 산물 상호 작용을 식별하거나 정제 된 단백질을 사용하는 아미노산 라벨이 붙은 정량질량 분석법에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Trypanosoma brucei에서단백질의 분석을 위해 최적화되어 있지만, 관련 원생 동물 기생충, 효모 또는 포유류 세포에 적응될 수 있다.

Introduction

이노시톨 인산염(IP) 및 인산염(PIs)은 유전자 발현 1,2,3,소포 인신매매 등의 세포 과정의 조절을 통해 진핵생물 생물학에 중심적인 역할을 한다. 4, 신호 변환5,6, 신진 대사7,8,9, 개발8,10. 이 대사 산물의 규정 하는 기능은 단백질과 상호 작용 하 고 따라서 단백질 기능을 조절 하는 그들의 능력에서 발생. 단백질에 의해 결합하는 경우에, IP 및 PIs는 단백질 형태11,촉매 활동12,또는 상호 작용13를 바꿀 수 있고 그러므로 세포 기능에 영향을 미칩니다. IP 및 P는 핵 2,3,14,15,벤아증망상 16,17,플라즈마와 같은 다중 세포 내 구획에 분포됩니다. 막1 및 시토졸18,단백질과 관련된3,19 또는 RNAs20.

인지질 C에 의한 막 관련 PI(4,5)P2의 절단은 INS(1,4,5)P3의 방출을 초래하며, 이는 각각 IP 키나아제 및 인산아제에 의해 인산화 또는 탈인될 수 있다. IP는 단백질에 결합하고 규제 기능을 발휘할 수 있는 가용성 분자입니다. 예를 들어, 메타조안에서의 Ins(1,4,5)P3는 IP3 수용체에 결합함으로써 제2 메신저로서 작용할 수 있으며, 이는 수용체 형태 변화를 유도하고 따라서 세포내저장소(11)로부터Ca2+의 방출을 유도한다. Ins(1,3,4,5)P4는 히스톤 데아세틸라제 복합체에 결합하고 단백질 복합체 조립 및 활성을 조절한다13. IP 조절 기능의 다른 예로는 염색질 조직21,RNA 수송22,23,RNA 편집24,및 전사 1,2,3의 제어가 포함됩니다. . 대조적으로, PIs는 종종 혈장 막 또는 세포막(25)에 단백질의 모집과 연관된다. 그러나, PIs의 새로운 특성은 비 membranous 환경에서 단백질과 연관하는 능력3,15,19,26. 이는 핵수용체 스테로이드성 인자, 이는 전사 조절 기능이 PI(3,4,5)P319에의해 조절되고, 효소 활성이 핵 PI(4,5)P226에의해 조절되는 폴리-A 폴리머라제이다. IP 및 PIs에 대한 조절 역할은 효모22,27,포유류 세포19,23, 초파리10 및 웜28을포함하는 많은 유기체에서 나타났다. 중요한 것은 진핵 혈통에서 일찍 발산한 trypanosomes에 있는 이 대사 산물의 역할입니다. 이러한 대사산물은 트리파노소마 브루시 전사 대조군1,3,발달8,세포생체발생 및 단백질 트래픽29,30에서 필수적인 역할을 한다. , 31세 , 도 32,병원체 T. 크루시33,34,35,톡소플라즈마36 및 플라스모듐의 발달 및 감염 조절에도 관여하고 있다. 5개 , 37. 따라서, trypanosomes에 있는 IP 그리고 P의 역할을 이해하는 것은 이 분자를 위한 새로운 생물학 기능을 해명하고 새로운 약 표적을 확인하는 것을 도울 수 있습니다.

단백질 및 IP 또는 PI 결합의 특이성은 이노시톨(13,38)의단백질 상호작용 도메인 및 인산화 상태에 의존하지만, PI의 지질 부분과의 상호작용도19로발생한다. 다양한 IP 및 PIs 및 이들의 변형 키나아제 및 인산염은 대사 산물 가용성 및 풍부, 이노시톨의 인산화 상태 및 단백질에 의해 영향을 받는 단백질 기능을 제어하기 위한 유연한 세포 메커니즘을 제공합니다. 상호 작용의친화성 1,3,13,38. 일부 단백질 도메인은39,40,41,예를 들어, 플렉스트린 상모도메인(42 및SPX)(S YG1/P ho81/X PR1) 도메인43을 잘 특성화하지만 ,44,45, 일부 단백질은 알 수없는 남아있는 메커니즘에 의해 IP 또는 PIs와 상호 작용합니다. 예를 들어, T. brucei의 억압자-활성제 단백질 1(RAP1)은 정식 PI 결합 도메인이 부족하지만 PI(3,4,5)P3 및 항원 변이에 관여하는유전자의 전사 를 제어하기 위해 상호작용한다 3. 친화성 크로마토그래피 및 IP 또는 PI 상호 작용 단백질의 친화성 크로마토그래피 및 질량 분석 분석trypanosome, 효모,또는 포유류 세포로부터 알려진 IP-또는 PI 결합 도메인 없이 여러 단백질을 확인8,46, 47. 데이터는 이러한 대사 산물에 결합하는 추가의 특성화되지 않은 단백질 도메인을 제안합니다. 그러므로, IP 또는 PIs와 상호 작용하는 단백질의 확인은 이 작은 분자를 위한 단백질 대사 산물 상호 작용 그리고 새로운 세포 조절 기능의 새로운 기계장치를 제시할 수 있습니다.

여기에서 기술한 방법은 IP 또는 PIs에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 서쪽 blotting 또는 질량 분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피를 채택합니다. 그것은 아가로즈 구슬에 공액 된 스트렙타비딘에 가교 또는 대안으로, 스트렙 타비딘 – 공액 자기 구슬을 통해 캡처 중하나 생체 생물 IP 또는 PI를 사용합니다 (그림 1). 이 방법은 민감하고 비방사성, 리포솜이 없는 간단한 워크플로우를 제공하며 세포 용해물 또는 정제된 단백질로부터 단백질의 결합을 검출하는데 적합하다(도 2). 이 방법은 복잡한 생물학적 샘플로부터 IP 또는 PI 결합 단백질을 식별하기 위해 아미노산 표지된 정량 질량 분석법47에 라벨이 없는8,46 또는 결합된 것으로 사용될 수 있다. 따라서, 이 방법은 세포 단백질과 IP 또는 PA의 상호 작용을 연구하기 위해 사용할 수있는 몇 가지 방법에 대한 대안이며, trypanosomes 아마도 다른 진핵생물에서 이러한 대사 산물의 조절 기능을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

Protocol

1. 친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅에 의한 IP- 또는 PI 결합 단백질 분석 세포 성장, 포해 및 친화성 크로마토그래피 T. 브루시 세포를 중간 로그 단계로 성장시키고 세포 생존 가능성과 밀도를 모니터링합니다. 총 5.0 x 107 세포는 하나의 결합 분석에 충분하다. 혈류 형태를 위해, HMI-9 매체에 있는 세포를 37°C 및 5% CO2에서 10% 태아소 혈…

Representative Results

RAP1 및 PI 분석 (3,4,5)친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅에 의한 P3 상호 작용이 예는 T. brucei 용해또는 재조합 T. brucei RAP1 단백질에 의해 RAP1에 의한 PI의 결합을 분석하기 위한 이 방법의 적용을 예시한다. Hemagglutinin (HA)태그 RAP1를 발현하는 T. brucei 혈류 량 형태의 Lysates 결합 검정에서 사용 되었다. RAP1은 변이체 표면 당단백질(VSG) 유전자의 전사<sup class="xref"…

Discussion

IP 또는 PIs에 결합하는 단백질의 확인은 이 대사 산물의 세포 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 서양 얼룩 또는 질량 분석법에 결합된 친화성 크로마토그래피는 IP 또는 PI 상호 작용 단백질을 식별하고 따라서 그들의 규제 기능에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. IP 또는 IP는 화학적으로 태그 [예를 들어, Ins (1,4,5)P3는 화학적으로 비오틴에 연결] 스트렙타비딘을 통해 아가로즈 구슬?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원되었다 (NSERC, RGPIN-2019-04658); 초기 경력 연구원을위한 NSERC 디스커버리 출시 보충 (DGECR-2019-00081) 및 맥길 대학에 의해.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
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Referências

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Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay

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Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
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