Интравитальная визуализация интраэпителиальных лимфоцитов в Murine Small Intestine
Summary
Мы описываем метод визуализации GFP-маркированных IELs с помощью интравитальной визуализации тонкой кишки murine с помощью перевернутой вращающейся дискки конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет отслеживать живые клетки в слизистой оболочке до 4 ч и может быть использован для исследования различных кишечных иммунно-эпителиальных взаимодействий.
Abstract
Интраэпителиальные лимфоциты, выражающие рецептор Т-клеток (яп. Отчасти из-за отсутствия окончательного лиганд для рецептора т-клеток, наше понимание регуляции активации IEL и их функции in vivo остается ограниченным. Это требует разработки альтернативных стратегий для изучения сигнальных путей, участвующих в регулировании функции IEL и реагирования этих клеток на местную микросреду. Хотя широко понимается, что IL ограничивают транслокацию патогенов, использование интравитальной визуализации имеет решающее значение для понимания пространственно-временной динамики взаимодействия IEL/эпителии в стабильном состоянии и в ответ на инвазивные патогены. В этом случае мы представляем протокол для визуализации мигрирующего поведения IEL в небольшой слизистой оболочке кишечника GFP и T-клеточной мыши с использованием перевернутой вращающейся дисковой конфокальной лазерной микроскопии. Хотя максимальная глубина изображения этого подхода ограничена по сравнению с использованием двухфотонных лазерно-сканирующих микроскопий, вращающийся диск конфокальной лазерной микроскопии обеспечивает преимущество высокоскоростного приобретения изображения с уменьшенным фотоотбелением и фотоповреждения. Использование 4D программного обеспечения для анализа изображений, поведение наблюдения Т-клеток и их взаимодействие с соседними клетками могут быть проанализированы после экспериментальных манипуляций, чтобы обеспечить дополнительную информацию об активации IEL и функции в слизистой оболочке кишечника.
Introduction
Интраэпителиальные лимфоциты (IEL) расположены в кишечном эпителии, и находятся как вдоль мембраны подвала и между соседними эпителиальными клетками в боковом межклеточном пространстве1. Существует примерно один IEL на каждые 5-10 эпителиальных клеток; эти IELs служат в качестве часовых для обеспечения иммунного наблюдения за большим пространством кишечного эпителиального барьера2. IEl, выражающий рецептор т-клеток (TCR), составляют до 60% от общей численности IEL в тонкой кишке мурин. Исследования на Т-клеточных недостаточномых мышах демонстрируют в значительной степени защитную роль этих клеток в ответ на кишечные травмы, воспаление и инфекцию3,4,5. Несмотря на поколение Tcrd нокаут мыши6, наше понимание биологии IEL остается ограниченным, отчасти из-за того, что лиганды, признанные TCR еще предстоит определить7. В результате, отсутствие инструментов для изучения этой популяции клеток затрудняет изучение роли активации ТКР и функционирования в физиологических и патологических условиях. Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали живые методы визуализации для визуализации миграционного поведения и взаимодействия с соседними энтероцитами в качестве средства для получения дополнительного анализа функции IEL и отзывчивости внешних стимулов in vivo.
За последнее десятилетие, интравитальная визуализация значительно расширила наше понимание молекулярных событий, участвующих в нескольких аспектах кишечной биологии, в том числе эпителиальной клетки пролить8, регулирование эпителиальной функции барьера9 ,10, миелоидные клетки выборки содержания светила11,12, и принимающей-микроб взаимодействия11,13,14,15,16 . В контексте биологии IEL, использование интравитальной микроскопии пролило свет на пространственно-временной динамики подвижности IEL и факторы, посредничающие их поведение наблюдения13,14,15, 16. Развитие TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) репортер мышей, который этикетки IELs по ядерной gFP выражение17, показал, что IL являются весьма motile в эпителии и проявлять уникальное поведение наблюдения, что реагирует на микробные инфекция17,13,14. Недавно была разработана еще одна мышь-репортер t(Tcrd-GDL), которая выражает GFP в цитоплазме, чтобы обеспечить визуализацию всей ячейки18. Аналогичная методология была использована для исследования потребности конкретных рецепторов хемокина, таких как G белковых рецепторов (GPCR)-18 и -55, на динамике подвижности IEL19,20. В отсутствие клеточного репортера флуоресцентные конъюгированные антитела против CD8 были использованы для визуализации и отслеживания подвижности IEL in vivo19,20. Хотя двухфотонная лазерная сканирующая микроскопия обычно используется для интравитальной визуализации, использование вращающейся дисковой конфокальной лазерной микроскопии обеспечивает уникальные преимущества для захвата высокоскоростных и высокопроизводительных многоканальных изображений с минимальным фоновым шумом. Эта технология идеально подходит для выяснения пространственно-временной динамики иммунных/эпителиальных взаимодействий в сложной микросреде слизистой оболочки кишечника. Кроме того, с помощью различных трансгенных и / или нокаут мыши модели, эти исследования могут обеспечить понимание молекулярной регуляции иммунной и /или эпителиальной функции клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Развитие методов интравитальной микроскопии дало беспрецедентную возможность наблюдатьреорганизацию субклеточных структур 8,9,22,клеточных взаимодействий12, 25 и клеточного миграционного поведения<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается NIH R21 AI143892, Нью-Джерси Фонд здравоохранения Грант, Буш биомедицинских Грант (KLE). Мы благодарим Мадлен Ху за помощь в редактировании рукописи и предоставлении данных, показанных в репрезентативных результатах.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
Referências
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
