פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור האפיון האימונוophenic ו ציטוקינים המושרה בידול של דם טבורי הנגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל לארבעה הלישנים מיאלואידים. היישומים של פרוטוקול זה כוללים חקירות על ההשפעה של מוטציות המחלה מיאלואידית או מולקולות קטנות על הבידול מיאלואיד של CD34+ תאים.
Abstract
הvivo לשעבר של תאי גזע אנושיים המטבטיים הוא מודל נפוץ לחקר המטפיאה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא עבור ציטוקינים המושרה הבידול של CD34+ המטפאות גזע ובתאי מחולל לארבעה תאים השושלת המייאלואידית. CD34+ תאים מבודדים דם טבורי הטבור האנושי ושיתוף תרבותי עם התאים MS-5 סטרומה בנוכחות של ציטוקינים. האפיון האימונוophenic של התאים גזע ומחולל קדמון, ואת התאים הבדיל מיאלואידית היוחסין מתוארים. באמצעות פרוטוקול זה, CD34+ תאים עשויים להיות מודבטים עם מולקולות קטנות או התמרה עם וירוסים כדי לבטא מוטציות המחלה מיאלואידית לחקור את השפעתם על בידול מיאלואידית.
Introduction
בידול רגיל של תאי גזע המטפאות (HSCs) הוא קריטי עבור תחזוקה של רמות פיזיולוגיות של כל תאי הדם הזמן. במהלך הבידול, בתגובה מתואמת כדי להביא רמזים מתוך כולל גורמי גדילה וציטוקינים, HSCs הראשון להצמיח לתאים רב-עוצמה (MPP) בתאי שיש להם פוטנציאל lympho-מיאלואידית1,2,3 ,4 (איור 1). MPPs להצמיח ושלתי מיאלואידית משותפת (CMPs) ו ושלתי הלימפה הנפוצות (CLPs) כי הם מוגבלים השושלת. CLPs להבדיל לתוך לתאי הלימפה המורכבת B, T, ואת התאים הטבעיים הרוצח. CMPs לייצר את לינאיד מיאלואידית באמצעות שתי אוכלוסיות מוגבלות יותר, מגקריוציט אריתרופואיד ושלתי (MEPs), ו גרנולוציט ושלתי (GMPs). MEPs להצמיח מגקריוציטים ו אריתרופוציטים, ואילו GMPs להצמיח גרנולוציטים ומונוציטים. בנוסף הנובעים דרך cmps, מגקריוציטים דווחו גם להתעורר ישירות מ HSCs או מוקדם mpps דרך שבילים לא קאנוניים5,6.
בתאי גזע ומחולל מצוי (HSPCs) מאופיינים על ידי סמן פני השטח CD34 וחוסר סמנים ספציפיים השושלת (לין–). סמנים פני השטח האחרים המועסקים בדרך כלל כדי להבחין בין אוכלוסיות HSCs ו מיאלואידית כוללות CD38, CD45RA, ו CD1232 (איור 1). HSCs ו-MPPs הם Lin–/cd34+/Cd38– ו-Lin-/cd34+/cd38+, בהתאמה. אוכלוסיית המייאלואיד המחויבת מאופיינת בנוכחות או היעדרות של CD45RA ו-CD123. Cmps הם lin–/cd34+/cd38+/cd45a–/cd123lo, gmps הם לין–/cd34+/cd38+/cd45a+/cd123lo, ו–meps הם לין-/cd34+ /Cd38+/cd45ra–/cd123–.
האוכלוסיה הכוללת של CD34+ גזע ותאים מחולל שיכול להיות מושגת בדם טבורי הטבורי דם (ucb), מח עצם, ו דם היקפי. CD34+ תאים מהווים 0.02% עד 1.46% של התאים הכולל של מונמונומנט (mncs) ב-ucb האנושיים, ואילו האחוזים שלהם משתנה בין 0.5% ל-5.3% במח העצם והוא נמוך בהרבה ב-~ 0.01% בדמו היקפי7,8,9 . היכולת ההתרבות והפוטנציאל לבידול של ucb נגזר CD34+ תאים הוא גבוה באופן משמעותי מזו של מח עצם או בתאי דם היקפיים1,10, ובכך מציע יתרון ייחודי להשגת חומר מספיק עבור ניתוחים מולקולריים בשילוב עם ביצוע האפיון אימונוopotypic ומורפולוגיים של התאים במהלך בידול.
Vivo הבדלה לשעבר של דם טבורי שנגזר CD34+ hspcs הוא מודל נרחב שהוחל לחקירת המטפיאה הרגילה ומנגנוני המחלה המטתית. כאשר מתורבתים עם ציטוקינים המתאים, ucb CD34+ hspcs יכול להיות המושרה להבדיל לאורך הלאואיד מיאלואידית או הלימפה11,12, 13,14,15 , 16. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לבידוד האפיון החיסונית של CD34+ hspcs מן האדם ucb, ועל הבידול שלהם לתאי השושלת המייאלואידית. מערכת זו של התרבות מבוססת על הבידול cy, המושרה על ידי HSPCs בנוכחות של התאים מסטרומה MS-5 לחקות את מיקרוסביבה במח העצם. תנאי התרבות לגרום התרחבות ראשונית של CD34+ תאים, ואחריו בידול שלהם לתאים המבטאים סמנים עבור ארבעה תאים השושלת מיאלואידית, כלומר גרנולוציטים (CD66b), מונוציטים (CD14), מגה קריוציטים (CD41), ו אריתרופוציטים (CD235a). יישומים של CD34+ תא בידול הפרוטוקול כוללים מחקרים על מנגנונים מולקולריים הוויסות המטטוזיס, וחקירות של ההשפעה של מחלות מיאלואידית הקשורים מוטציות ומולקולות קטנות על התחדשות עצמית ו בידול של HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מתאים הבידול vivo לשעבר של UCB נגזר CD34+ hspcs לארבע לינאיד מיאלואידית. הדגירה הראשונית עם תערובת cy, המורכב SCF, TPO, Flt3L ו IL3 מעוררת CD34+ תאים. לאחר מכן, הבידול מושגת עם קוקטייל של SCF, IL3, Flt3L, אריתרופואיטין ו TPO. בתמהיל זה, SCF, IL3, ו-Flt3L חשובים להישרדות והתפשטות של CD34+ HSCS. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות וונדי בארט, רחל Caballero, וגבריאלה רואיז מחקלאות מערכות בריאות משולבות ליחידות דם טבורי מזוהה ותרם, Mrinalini קאלה לסיוע עם הזרימה cy, ו נוכלים גיי וכריסטופר Seet עבור עצה על בידול vivo מיאלואידית לשעבר. עבודה זו היתה נתמכת על ידי כספים כדי אס מ המכונים הלאומיים לבריאות (R21CA170786 ו R01GM127464) והחברה האמריקנית לסרטן (מענק המחקר המוסדי 74-001-34-IRG). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
Referências
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
