Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы
Summary
Мы охарактеризовали новый белок киназы, используя надежные биохимические подходы: анализ Western Blot с выделенным специфическим антителом на различных клеточных линиях и тканях, взаимодействие экспериментов по коиммунопреции, активность киназы, обнаруженная вестерном Помарка с использованием фосфо-специфических антител и по маркировке АТФ32P.
Abstract
Обширное секвенирование всего генома выявило множество открытых кадров чтения (ORF), предоставляющих много потенциальных белков. Эти белки могут иметь важную роль для клетки и могут распутать новые клеточные процессы. Среди белков, киназы являются основными субъектами, поскольку они принадлежат к клеточной сигнализации путей и имеют возможность включения или выключения многих процессов, имеющих решающее значение для судьбы клетки, таких как рост клеток, деление, дифференциация, подвижность, и смерть.
В этом исследовании мы сосредоточились на новом потенциальном белке киназы, LIMK2-1. Мы продемонстрировали его существование Western Blot с помощью специфического антитела. Мы оценили его взаимодействие с восходящим регуляющим белком с помощью экспериментов по коиммунопреционированию. Coimmunoprecipitation является очень мощным методом, способным обнаружить взаимодействие между двумя белками цели. Он также может быть использован для обнаружения новых партнеров белка приманки. Белок приманки может быть очищен либо с помощью тега инженерии его последовательности или через антитела специально ориентации его. Эти белковые комплексы могут быть разделены SDS-PAGE (Натрий Dodecyl Сульфат Полиаккриламид гель) и определены с помощью масс-спектрометрии. Иммунопрецицифицированный LIMK2-1 также использовался для проверки своей киназы в пробирке по маркировке АТФ32P. Этот устоявшийся асссможет использовать множество различных субстратов, а мутившие версии приманки могут использоваться для оценки роли конкретных остатков. Эффекты фармакологических агентов также могут быть оценены, поскольку этот метод является высокочувствительным и количественным. Тем не менее, обработка радиоактивности требует особой осторожности. Активность киназы также может быть оценена с помощью специфических антител, нацеленных на фосфо-группу модифицированной аминокислоты. Эти виды антител не являются коммерчески доступными для всех фосфо модифицированных остатков.
Introduction
На протяжении многих десятилетий, многочисленные сигнальные пути были выяснены и их участие в важнейших клеточных процессов, таких как деление клеток, дифференциация, подвижность, запрограммированная гибель клеток, иммунитет и нейробиологии, было показано. Киназы играют значительную роль в этих сигнальных путей, поскольку они часто тонко регулируют их активацию или инактивацию и являются частью переходных универсальных комплексов, которые реагируют на внешние раздражители1,2,3. Мутация и дисрегуляция киназы часто приводят к заболеваниям у людей, и поэтому они стали одной из наиболее важных целей наркотиков за последние сорок лет4.
В этом контексте важно иметь возможность обнаруживать взаимодействие киназы с их регуляторами или субстратами вниз по течению и выявлять новых партнеров. Очищение аффинита и иммунопрецит очень мощные методы изоляции белковых комплексов5. Белок приманки или киназы могут быть помечены с конкретной последовательности пептида позволяет использовать коммерческие бусы ковалентно в сочетании с антителами ориентации пептида. Этот материал позволяет высокую воспроизводимость в экспериментах6,7,8. Эндогенные белки также могут быть иммунопреципиципированы с помощью антител, нацеленных непосредственно на белок приманки. Антитела могут быть связаны с протеином А или белок G агарозных бусин или просто инкубируются этими бусинами до добавления лизата. Лисис буферы должны быть оптимизированы, чтобы позволить растворить белок, не теряя взаимодействия и избежать деградации белка. Основным недостатком этого подхода является то, что взаимодействие обнаруживается при клеточном лисисе; поэтому, преходящее или слабое взаимодействие, вместе с теми, которые требуют субклеточного контекста могут быть пропущены. Другие методы могут быть использованы для работы непосредственно в клетке, таких как Близость Ligation Assay (PLA)9, в vivo кросс-ссылок сродство очистки (XAP)10, Биолюминесценция Резонансная передача энергии (BRET) или Фюрстер Резонанс энергии Трансфер (FRET)11,12. Кроме того, иммунопрецитифиция не подходит для определения термодинамических констант привязки, для которых требуются физические методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс, истермальная калорийность или микромасштабная термофорез 13,14.
Активность киназы может быть оценена с помощью нескольких методов. В этом, мы сосредоточились на фосфо-специфических антител и in vitro No32P » ATP (Аденозин ТриФосфат) маркировки. Фосфо-специфические антитела нацелены на модификацию фосфатов определенного остатка белка. Они могут быть использованы в Западной помарки или ELISA (Фермент-связанных иммуносорбентных асссе) после лизиса клеток, для иммуногистохимии, а также на неповрежденных клеток с использованием цитометрии потока или иммунофлуоресценции. Их недостатки могут включать в себя их отсутствие специфичности, которые могут быть оценены с помощью мутировавшей версии целевого белка, и их не коммерчески доступны для всех белков. Маркировка In vitro No32P’ ATP является очень надежным, хорошо зарекомендовавшим себя и высокочувствительным методом15. Можно использовать иммунопромилиациированные или рекомбинантные белки, а также различные субстраты. Воздействие лекарств также может быть оценено, поскольку этот метод является количественным. Его основным недостатком является то, что радиоактивность, связанная с подходом, требует осторожного обращения. Возможны также альтернативные методы, основанные на измерении флуоресцентных или люминесцентных пептидных субстратов и пользующихся измененными флуоресцентными/люминесцентными свойствами при фосфорилировании. Такие методы также позволяют высокую пропускную связь, что требуется, например, при скрининге молекул, которые могут быть потенциальными ингибиторами мишени киназы. Действительно, киназы представляют собой один из крупнейших классов наркотиков целей, проводимых фармацевтическими компаниями16.
В этом исследовании мы сосредоточились на белке LIMK2-1 (LIMK2-1 означает Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Белок киназы LIMK2 был впервые описан в 1995году 17. Три изоформы LIMK2 производятся с помощью альтернативного сплайсинга: LIMK2a, LIMK2b и LIMK2-1. В настоящее время LIMK2-1 описан только на уровне мРНК в одном исследовании18. В этом мы характеризуем этот потенциальный новый белок киназы на молекулярном уровне, используя надежные биохимические подходы. Во-первых, мы демонстрируем, что LIMK2-1 действительно синтезируется. Как и два своих аналога, LIMK2a и LIMK2b, он взаимодействует с восходящей киназы ROCK (Rho-связанных белка киназы). Мы показываем, что LIMK2-1 имеет активность киназы на Myelin Basic Protein (MBP), но не на кофилине, каноничном субстрате киназы LIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
При этом мы использовали надежные биохимические инструменты, чтобы охарактеризовать на молекулярном уровне новый белок, LIMK2-1, который считается киназой на основе его последовательности и его омологов, LIMK2a и LIMK2b20.
Во-первых, мы продемонстрировали существова?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана La Ligue contre le Cancer, l’Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, и La R’Gion Centre Val de Loire. Большое спасибо Орели Коссон и Дебора Касас за данные цитометрии потока, и Кейрон Хикман-Льюис для тщательного проверки рукописи.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
Referências
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neurociência. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
