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Bioquímica

Mesure fluorescente semi-automatisée en temps réel du pH liquide de la surface des voies respiratoires des cellules épithéliales des voies respiratoires primaires de l’homme

Published: June 13, 2019
doi:
10.3791/59815
, , , , , ,
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children’s Hospital,Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

Nous présentons un protocole pour faire des mesures dynamiques de la surface des voies respiratoires pH liquide dans des conditions de film mince à l’aide d’un lecteur de plaque.

Abstract

Au cours des dernières années, l’importance du pH de la surface de la muqueuse dans les voies respiratoires a été soulignée par sa capacité à réguler l’hydratation de la surface des voies respiratoires (ASL), la viscosité du mucus et l’activité des peptides antimicrobiens, les paramètres clés impliqués dans la défense innée de la Poumons. Ceci est d’une importance primordiale dans le domaine des maladies respiratoires chroniques telles que la fibrose kystique (FC) où ces paramètres sont dysréglementés. Alors que différents groupes ont étudié le pH de l’ASL à la fois in vivo et in vitro, leurs méthodes signalent une gamme relativement large de valeurs de pH ASL et même des constatations contradictoires concernant les différences de pH entre les cellules non-CF et les lymphocytes CF. En outre, leurs protocoles ne fournissent pas toujours suffisamment de détails afin d’assurer la reproductibilité, la plupart sont à faible débit et exigent un équipement coûteux ou des connaissances spécialisées à mettre en œuvre, ce qui les rend difficiles à établir dans la plupart des laboratoires. Ici, nous décrivons un essai semi-automatisé de lecteur de plaque fluorescente qui permet la mesure en temps réel du pH ASL dans des conditions de film mince qui ressemblent plus étroitement à la situation in vivo. Cette technique permet des mesures stables pendant de nombreuses heures à partir de plusieurs cultures de voies respiratoires simultanément et, surtout, des changements dynamiques dans le pH ASL en réponse à des agonistes et des inhibiteurs peuvent être surveillés. Pour ce faire, l’ASL des cellules épithéliales des voies respiratoires primaires entièrement différenciées (hAECs) est tachée du jour au lendemain avec un colorant sensible au pH afin de permettre la réabsorption de l’excès de liquide pour assurer des conditions de film mince. Après la surveillance de la fluorescence en présence ou en absence d’agonistes, l’étalonnage du pH est effectué in situ pour corriger le volume et la concentration de colorant. La méthode décrite fournit les contrôles requis pour effectuer des mesures de pH ASL stables et reproductibles, qui pourraient finalement être utilisées comme plate-forme de découverte de médicaments pour la médecine personnalisée, ainsi que adaptées aux autres tissus épithéliaux et aux telles que les modèles inflammatoires et/ou hôtes-pathogènes.

Introduction

L’épithélium des voies respiratoires est recouvert d’une mince couche de fluide (~ 10 μM) appelée le liquide de surface des voies respiratoires (ASL). La composition et la profondeur (hydratation) de cette ASL est étroitement régulée et contrôle l’efficacité de la clairance des voies respiratoires par l’escalator mucociliaire1,2,3,4. Ces dernières années, l’importance de l’ASL H+/HCO3– contenu a été démontrée par différents groupes en raison de sa capacité à réguler l’hydratation ASL5, l’inflammation des voies respiratoires6 et l’infection7, 8 ainsi que la viscosité de mucus8,9. Fait important, bien qu’il existe certaines controverses, de nombreuses études ont rapporté une dysrégulation du pH des voies respiratoires dans les maladies chroniques des voies respiratoires telles que l’asthme10,11,12, BPCO11, bronchectasie11, rhinosinusitechronique13,14 et fibrose kystique (CF)5,9,15,16,17, qui suggère que les thérapies qui rétablissent le pH ASL pourraient être utiles pour traiter plusieurs types de maladies chroniques des voies respiratoires. Les FC sont la maladie génétique autosomique récessive la plus répandue chez les populations caucasiennes et est due à des mutations du gène du régulateur de conductance transmembranaire des FC (CFTR). Ce gène code un anion (HCO3– et CL–) canal qui joue un rôle crucial dans le transport ionique et fluide et l’homéostasie à travers l’épithélium18. Bien que les FC soient une maladie multi-organes, la pathologie pulmonaire est la principale cause de morbidité et de mortalité19,20 et compte tenu du défaut primaire dans les FC est un transport avec facultés affaiblies de CL– et HCO3–, On peut émettre l’hypothèse que le pH du liquide extracellulaire chez les personnes atteintes de FC sera dysréglementé par rapport aux personnes qui n’ont pas de CF. ainsi, la mesure du pH ASL a été un domaine d’actualité de la recherche des FC et différents groupes ont développé des techniques pour mesurer le pH ASL dans les FC Airways.

In vivo, le pH des voies respiratoires a été mesuré en utilisant différentes techniques, des micro-sondes (sondes à fibre optique, or ou mobidium)5,21,22,23,24 à des mesures de pH de matériel expectoré ou condensat expiré (EBC)10,11,12,25,26,27. Dans le domaine de la recherche des FC, le pH est largement étudié en raison de ses implications cliniques potentielles. Théoriquement, rendre les voies respiratoires plus alcalines pourrait augmenter la mort bactérienne et améliorer la clairance mucociliaire et l’homéostasie des voies respiratoires dans son ensemble. Cependant, les études in vivo/ex vivo signalent un large éventail de valeurs de pH, et à ce jour, les résultats ne sont pas concluants en ce qui concerne l’existence d’une différence de pH entre les voies respiratoires non-CF et cf. Au début des années 2000, différents groupes ont rapporté le pH de l’EBC. Chez les groupes non malades, les valeurs de pH allaient de 4,6 à 8,5, mais il est intéressant de noter que le pH de l’EBC a été plus acide pendant les exacerbations chez les personnes atteintes de CF12,27. Plus récemment, les mesures in vivo de l’ASL dans les modèles humains et animaux des FC ontrapporté des résultats contradictoires16,17,21,22,23, 24 et il n’est toujours pas clair si les voies respiratoires des FC sont plus acides que les voies respiratoires non-cf.

Comme la mesure in vivo du pH inférieur ASL s’est avérée difficile en raison de la très petite quantité de fluide qui tapit les voies respiratoires et la présence potentielle de bouchons de mucus dans la maladie, de nombreux groupes se sont tournés vers des expériences in vitro pour mesurer le pH ASL, principalement en utilisant trois différents Méthodologies. La première approche utilise des colorants fluorescents sensibles aux cellules couplés au dextran, qui sont ajoutés sous forme de poudre sèche, soit directement à l’ASL, soit en utilisant un fluide inerte appelé perfluorocarbone (PFC)5,8,16 , le 17 , le 28 , le 29 , la trentaine , le 31 , 32cependant, cette technique fournit peu de contrôle sur la quantité exacte de colorant qui est ajoutée aux cultures et présente un risque d’agrégats de colorant et de grandes différences de concentration entre les échantillons et/ou les expériences et même dans le même échantillon . Il a également été généralement réalisé avec un microscope confocale, ce qui limite son applicabilité et dans de nombreux cas, empêche la surveillance détaillée de plusieurs échantillons et des changements dans les conditions d’enregistrement. La deuxième méthode employée pour mesurer le pH ASL est l’utilisation de microélectrodes sensibles au pH5,15. Les mesures de pH ASL ne dépendent donc pas de la concentration de colorant fluorescent et devraient donner des résultats plus robustes et reproductibles. Cependant, cette méthode ne permet pas de mesures dynamiques en temps réel du pH ASL, et il n’est pas facile de faire des lectures multiples dans des conditions différentes. Il s’agit également d’un processus complexe et intensif qui nécessite un équipement spécialisé (fabrication de microélectrodes/dispositifs d’enregistrement électrophysiologiques) et une formation pour la collecte des échantillons pour la mesure et l’étalonnage ultérieurs du pH. En outre, ces deux techniques ont également montré quelques incohérences dans la capacité de produire des résultats reproductibles: en utilisant la méthode de colorant fluorescent sensible au pH, Tang et coll. ont rapporté des valeurs de 7,35 pour les non-FC ASL et 7,0 pour CF ASL8 alors que dans un plus document récent du même groupe, le pH ASL était de 6,9 et 6,4 pour les non-FC et les FC, respectivement17. De la même façon, les mesures des microélectrodes ont donné des valeurs de 6,4 dans les ASL non-CF et 6,1 dans les FC ASL dans une étude de 200315 alors que le même groupe a rapporté des valeurs de 6,7 pour les ASL non-cf et 6,45 pour les FC ASL dans une étude de 20135. Enfin, dans la troisième approche, les chercheurs ajoutent un volume relativement important de solution faiblement tamponnée sur la surface apicale (muqueuse) des cultures, détruisant ainsi les conditions du film mince et modifiant la composition de l’ASL, et potentiellement sa régulation. le pH est ensuite mesuré soit à l’aide de colorants fluorescents sensibles au pH33, par une méthode de titrage pH-Stat dans une chambre d’Ussing13,14, soit il faut retirer l’ASL dilué des cultures et le pH mesuré à l’aide d’un pH électrode, analyseur ou bandes de tournesol34. Une autre difficulté dans la mesure exacte du pH ASL est l’établissement d’une courbe standard qui est aussi précise que possible. En effet, si les lectures sont effectuées avec une électrode qui mesurera la différence de potentiel électrique par l’intermédiaire d’une résine ou utilisant des colorants fluorescents sensibles au pH, ces deux approches seront affectées par le microenvironnement local des échantillons étant mesuré. Plus précisément, la constante de dissociation (KD) des colorants peut varier considérablement en fonction de la température, de la force ionique, de la viscosité ainsi que des interactions potentielles du colorant avec les constituants cellulaires tels que les protéines et potentiellement mucus.

Afin d’essayer de surmonter un grand nombre de ces problèmes techniques, ainsi que de développer une méthode de débit plus dynamique, plus simple et plus élevée, nous avons établi une technique in vitro qui enregistre le pH de l’ASL dans les cultures primaires de hAEC à l’aide d’une cellule-insensible au pH colorant fluorescent dans un lecteur de plaque standard. La méthode génère des mesures reproductibles, dynamiques, semi-automatisées et en temps réel du pH ASL de cultures cellulaires 3D entièrement différenciées dans des conditions de film mince. Grâce à l’utilisation d’un lecteur de plaques à plusieurs puits, ce dosage semi-automatisé peut faire près de mesures simultanées de pH pour un maximum de 24 conditions sur 12 h et peut surveiller l’effet de l’ajout de divers agonistes ou inhibiteurs. Dans cet article, nous décrivons la méthodologie en détail et nous rapmettons des résultats représentatifs dans des conditions de contrôle positives et négatives qui validant la technique.

Protocol

Primaire non-CF (n = 3 donneurs, âge 34, 27 et 23 ans) et CF (n = 3 donateurs, tous F580del/F508del; âge 40, 41, inconnu) les hAECs étaient un cadeau aimable du Dr Scott H. Randell (Marsico Lung Institute, de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, États-Unis) et étaient obtenai en vertu du protocole #03-1396 approuvé par l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill Conseil d’examen des établissements biomédicaux. Les cellules ont été cultivées selon des méthodes précédemment publiées en utilisant les milieux de croissance et de différenciation décrits par Fulcher et Randell35,36. 1. préparation de l’échantillon Cultiver des haecs primaires sur des supports semi-perméables de diamètre 6,5 mm (table des matières) à l’interface air-liquide pendant au moins 28 jours, comme décrit précédemment35,36. Préparer 50 ml de solution stérile de solution tampon de Krebs contenant du HCO3 (HCO3- krb, les concentrations sont données en mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl2 (1), MgCl2 (1), D-glucose (5)) et le filtre-stériliser à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Changez le milieu basolatéral à la différenciation fraîche comme décrit dans 1,135,36.NOTE: il a été démontré que la concentration basolatérale de glucose affecte le pH33de ASL. À ce stade, la teneur en glucose du compartiment basolatéral peut être contrôlée en remplaçant le milieu par des solutions tamponnées de concentrations connues de glucose. Laver la surface apicale des cellules en ajoutant 150 μL de HCO3- KRB et incuber pendant 20 min à 37 ° c, 5% co2. Retirer le lavage apicale sans perturber l’épithélium en l’aspirant avec précaution à l’aide d’une pipette Pasteur stérile en verre et d’un embout de pipette stérile P200 relié à une pompe aspirante qui crée un vide dans la bouteille de prélèvement. À ce stade, il devrait y avoir aussi peu de liquide restant sur la surface apicale que possible pour rétablir l’interface air-liquide. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° c, 5% CO2. 2. mesure de fond Allumez le lecteur de plaques et l’ordinateur. Ouvrez le tableau de bord. Cliquez sur Spark 10m, ouvrez la commande de température et réglez à 37 ° c. Ouvrez la commande de gaz et réglez le CO2 à 5%. Attendez que la température et le CO2 aient atteint leurs cibles. Ouvrez le tiroir du lecteur de plaque, insérez la cassette d’humidité remplie de 6 mL de dH2O de chaque côté. Assurez-vous que le couvercle et le fond de la plaque sont propres-sinon, nettoyez avec 70% d’éthanol sur un morceau de tissu-et placez la plaque dans la cassette d’humidité.Remarque: tout au long de l’expérience, le couvercle de la plaque de culture tissulaire est conservé sur la plaque et seulement enlevé lors de l’ajout de médicaments ou de la modification du milieu basolatéral, qui sont effectuées dans une hotte à écoulement laminaire de culture tissulaire pour garder les cultures dans un environnement stérile. Ouvrez l’éditeur de méthode Spark et configurez les paramètres sur le logiciel comme suit: Sélectionnez le gabarit de plaque approprié (pour les supports semi-perméables de diamètre 6,5 mm, sélectionnez la plaque de 24 puits) et les puits qui seront surveillés pendant cette expérience. Ajouter une température et un panneau de contrôle CO2 et les régler à 37 ° c et 5%, respectivement. Cochez l’ attente pour les boîtes de température/gaz . Ajoutez un panneau de boucle cinétique et sélectionnez la durée comme type de boucle et réglez-le à 5-10 min. Choisissez non défini comme type d’intervalle pour activer la lecture continue.Remarque: le timing de la lecture continue dépend du nombre de puits/conditions. 5 min est assez long pour 6-12 puits alors qu’une plaque complète contenant 24 conditions nécessitera 10 min de mesures continues. Dans la boucle cinétique, ajouter deux panneaux “intensité de fluorescence”, en utilisant la fonction glisser-déposer, qui sera mis en place pour les colorants fluorescents sensibles au pH et insensible au pH, respectivement. Réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 560 et 590 Nm respectivement pour le colorant sensible au pH et 495 et 520 nm, respectivement, pour le colorant insensible au pH. Réglez le nombre de clignotements à 30 et la position z à 33200 pour chaque fluorophore.Remarque: les réglages de position z et de gain dépendent des caractéristiques du lecteur de plaque. Réglez le gain manuellement à une valeur qui donnera un nombre assez élevé de sorte que les différences entre les échantillons seront ramassés, mais assez bas de sorte que l’addition d’un agoniste ne génère pas de valeurs hors de la plage de détection. Réglez la lecture multiple par puits à l’utilisateur défini comme un type de cercle de taille 3 × 3 avec une bordure de 4750 μm. Cliquez sur le bouton de démarrage pour effectuer une mesure d’arrière-plan et sur OK pour confirmer que le couvercle de la cassette d’humidité est en place. À la fin de la mesure, ouvrez le tiroir du lecteur de plaque, sortez la plaque et pplacez la cellulesil dans l’incubateur tout en préparant la solution de mélange de colorant fluorescent. Préparer la solution de mélange de colorant fluorescent en ajoutant 2 μl de colorant fluorescent thermosensible au pH (phsens) à 1 mg/ml de dextran à 0,2 μl de colorant fluorescent à 10 mg/ml (phins) insensible au pH et à 0,8 μl de HCO3- KRB stérile pour une finale volume de 3 μL par condition.NOTE: le volume total de la solution de mélange de colorant doit être préparé pour n puits + 1 s’il y a entre 1 et 10 échantillons, ou n puits + 2 s’il y a entre 11 et 24 échantillons. Les colorants couplés au dextran sont reconstitués dans une solution HCO3- KRB filtrée-stérile, aliquotée et stockée à-20 ° c. Tout produit chimique peut être ajouté à ce stade pour une période d’incubation de 16-24 h37 sur la surface apicale. Les produits chimiques doivent être préparés comme 0,1 x, car le volume final, après absorption de l’excès de liquide par la culture, sera d’environ 0,3 μL pour un support semi-perméable de diamètre 6,5 mm. Ajouter délicatement 3 μL de mélange de colorant (voir 2,8) à la surface apicale des cellules et incuber pendant la nuit à 37 ° c, 5% CO2. mesure 3. Kinetic Répétez les étapes 2,1 à 2,4 pour préparer le lecteur de plaque. Cliquez sur l’icône ouvrir et sélectionnez le fichier de méthode utilisé pour les mesures d’arrière-plan Dans le panneau de boucle cinétique, maintenez le type de boucle comme Duration et réglez-le à 08 heures. Remplacez le type Interval par Fixed et réglez-le sur 5 minutes. Conservez les panneaux intensité de fluorescence de la même manière que pour les mesures d’arrière-planRemarque: le type d’intervalle pour les mesures d’arrière-plan est défini sur «non défini» afin de permettre la lecture continue. Pour les expériences cinétiques et d’étalonnage, le type d’intervalle est réglé sur “fixe” avec un intervalle de 5 min. Cela peut être ajusté en fonction de la conception de l’expérience et du nombre de conditions. Ouvrez le tiroir du lecteur de plaque; Insérez la cassette d’humidité remplie de 6 mL de dH2O de chaque côté. Assurez-vous que le couvercle et le fond de la plaque sont propres-sinon, nettoyez avec 70% d’éthanol sur un morceau de tissu-et placez la plaque dans la cassette d’humidité, avec son couvercle. Démarrez les lectures de fluorescence en cliquant sur Démarrer. Cliquez sur OK après avoir assuré que le couvercle de la cassette d’humidité est en place. Après n cycles, généralement entre 12 et 24, ce qui équivaut à 1 à 2 heures, cliquez sur Pause pour interrompre l’expérience. Prendre la plaque et appliquer tous les médicaments/agonistes basolaterally aux différents échantillons.Remarque: lorsque les cellules sont prises hors du lecteur de plaque, CO2 s’échappe et cela induira une augmentation du pH ASL comme indiqué par une baisse de la fluorescence de colorant sensible au pH. Ce changement de pH induit par le CO2s’inverse dans les 10-15 min après avoir replacé les cultures dans le lecteur de plaques. Remettez la plaque dans la cassette d’humidité sur le plateau, repositionnez le couvercle de la cassette d’humidité et cliquez sur Continuer afin d’enregistrer davantage de pH ASL et de surveiller l’effet des médicaments/agonistes sur le pH ASL. 4. étalonnage in situ du pH Sortez la plaque du lecteur de plaque. Aspirer le milieu/solution basolatéral. Ajouter 750 μL et 1 μL de solutions de courbe standard hautement tamponnées au compartiment basolatéral et à la surface apicale, respectivement.Remarque: les solutions de courbes standard hautement tamponnées contiennent (en mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), MgCl2 (1,2), NAHEPES ou MES ou tris (100 mm). Utiliser MES pour les solutions tampons avec un pH inférieur à 7, NaHEPES pour les solutions de pH 7-7.5 et tris pour la solution avec pH 8. Fixez le pH à la valeur désirée à l’aide de HCl. Mettez le CO2 hors tension sur le lecteur de plaque ou réglez-le à 0,1% et replacez la plaque dans la cassette d’humidité. Configurez le lecteur de plaques avec les mêmes paramètres que ceux décrits précédemment, mais sans CO2 comme à l’étape 3,2. Commencer les lectures de fluorescence, toutes les 5 min pendant 1-1,5 h. 5. évaluation de l’effet de la concentration de colorant et du volume de suspension sur les données d’étalonnage Préparez suffisamment de mélange de colorant sensible au pH et insensible pour enregistrer la fluorescence à un minimum de 4 valeurs de pH différentes dans 3 volumes différents.NOTE: ici, mélanger 1 a été préparé avec 26 μL de pH sensible (1 mg/mL) et 2,6 μL de pH insensible (10 mg/mL) et mélanger 2 avec 13 μL de pH sensible (1 mg/mL) et 1,3 μL de pH insensible (10 mg/mL). Distribuer 2,2 μL ou 1,1 μL de mélange 1 ou 2, respectivement, dans 12 puits d’une plaque de puits 96 et ajouter suffisamment de solutions d’étalonnage pour obtenir des volumes finaux de 50, 100 ou 200 μL et bien mélanger.Nota: dans cette configuration, les dénombrements de fluorescence seront enregistrés pour les concentrations de colorants de 5 μg/mL (en 200 μL), de 10 μg/mL (en 100 ou 200 μL), de 20 μg/mL (en 50 ou 100 μL) ou de 40 μg/mL (en 50 μL). Allumez le lecteur de plaque, réglez la température à 37 ° c et insérez la plaque dans le lecteur de plaque. N’allumez pas le contrôleur CO2 .Remarque: comme il s’agit d’une expérience courte et ne nécessite que suffisamment de temps pour équilibrer la température, la cassette d’humidité n’est pas nécessaire. Réglez la position z et le gain pour la plaque de puits 96 et utilisez les mêmes paramètres que pour l’expérience effectuée sur des supports semi-perméables. 6. analyse des données Enregistrez toutes les données dans des feuilles de calcul et créez un nouveau fichier. Dans le fichier d’arrière-plan, sélectionnez toutes les données moyennes pour chaque échantillon/condition pour les longueurs d’onde, copiez et collez dans le nouveau fichier. Calculez le fond moyen pour chaque puits et chaque longueur d’onde. Répétez cette étape avec les données d’étalonnage et de cinétique et soustrayez l’arrière-plan de chaque point de données pour chaque longueur d’onde. Pour chaque point de temps et chaque échantillon, calculez le rapport entre la fluorescence sensible au pH et la Si tous les échantillons ont été obtenus à partir d’un donneur individuel, calculer la moyenne des ratios à chaque point de temps de la courbe d’étalonnageRemarque: il est important de générer autant de courbes d’étalonnage que de donneurs ou de solutions basolatérales. En effet, ces paramètres peuvent affecter les lectures de fond ou le taux d’absorption du fluide, qui à son tour affectera la concentration de colorant et donc le pH calculé. Pour chaque point temporel, générez une courbe standard à partir des ratios, en traçant les valeurs de pH connues sur l’axe des abscisses et les ratios sur l’axe des ordonnées. Déterminez le point de temps à partir duquel les ratios sont stables, ajuster une ligne de régression linéaire et obtenir l’équation de cette ligne. À partir des données cinétiques, calculez le pH pour chaque point temporel et tracez le pH sur l’axe des y et le temps sur l’axe des abscissesRemarque: le pH de repos/basal peut être calculé en calculant les points de données sur la mesure stable du pH avant l’addition de tout agoniste ou de toute autre intervention. L’effet d’un agoniste peut être caractérisé en calculant la différence de pH avant et après (un certain laps de temps) le traitement ou en ajustant une courbe non-linéaire aux points de données directement après l’intervention. Cela donnera des informations supplémentaires sur le t1/2 et la valeur maximale. Enfin, les taux d’acidification ou d’alcalinisation peuvent également être obtenus à partir de la pente d’une ligne droite ajustée aux premiers points après l’intervention.

Representative Results

La technique décrite ci-dessus permet la mesure dynamique du pH ASL dans jusqu’à 24 cultures de hAECs primaires distinctes. La figure 1 montre un schéma des étapes principales et de l’équipement mis en place. Les cellules chargées pendant la nuit sont placées dans un lecteur de plaques CO2 et à température contrôlée, dans lequel la fluorescence des colorants sensibles au pH et insensible au pH du dextran est enregistrée toutes les 5 min. Figure 1: schéma de la méthode de mesure du pH ASL. Après avoir lavé les cultures et effectué une lecture de fond, les cellules épithéliales des voies respiratoires primaires de l’homme (hAECs) ASL sont chargées avec du dextran couplé pH-sensible et un mélange de colorant insensible au pH pendant la nuit à 37 ° c, 5% CO2. Le jour suivant, la plaque est transférée à une température et le lecteur de plaque contrôlé par CO2et la fluorescence des deux colorants est enregistrée au fil du temps. Après l’expérience, un étalonnage in situ est effectué et les données analysées et présentées sous forme de pH ASL au fil du temps. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Premièrement, nous avons étudié l’effet de différents volumes et concentrations de colorant sur le nombre de fluorescence et donc sur le ratio de 560/495. En effet, le but d’ajouter le pH insensible au colorant pH-sensible est de corriger pour la variabilité du chargement ASL. Cependant, il était important de tester cette hypothèse et d’évaluer si nous pouvions utiliser une courbe d’étalonnage standard effectuée en l’absence de cellules dans une plaque de puits 96 pour toutes les expériences et les types de cellules. Nous avons surveillé les dénombrements de fluorescence sur 1 h en 50, 100 ou 200 μl de solutions d’étalonnage (à pH 5,5, 6,5, 7 ou 8) contenant 5, 10, 20 ou 40 μg/mL de colorants. Les résultats sont présentés dans la figure 2a-C, et montrent que pour le même pH et la même concentration de colorants, le rapport d’émission de phsens/phines rapporté (560/495 sur l’axe des y) diffère selon le volume (figure 2a). En outre, au même pH et même volume, différentes concentrations de colorant fournissent des valeurs de ratio différentes (figure 2b). Par conséquent, les variations de volume ou de concentration de colorant affecteront la valeur absolue du pH calculée à partir du rapport d’émission. La Figure 2c montre que le temps nécessaire à l’équilibrage de la température est d’environ 15-20 min. Pour confirmer l’effet de la concentration de colorant et du volume sur les ratios d’émission, nous avons enregistré la fluorescence des colorants chargés dans l’ASL des hAECs primaires non-CF et FC in situ. Nous avons ensuite effectué l’étalonnage et analysé les résultats en (1) en générant une courbe standard globale à partir de tous les échantillons ou (2) en générant deux courbes standard indépendantes pour chaque type de cellule (non-CF et CF). Le pH ASL des deux types de cellules a ensuite été tracé en fonction du temps (figure 3A, B) et de la moyenne (figure 3C). Les valeurs de pH ASL obtenues à partir d’une seule courbe standard mondiale ont montré une différence significative entre les cultures non-CF et CF (figure 3A, C) alors que le pH de l’ASL n’était pas significativement différent entre les FC et les haecs non-CF lorsque le pH était calculé à partir les courbes standard indépendantes (figure 3B, C). Ces résultats montrent l’importance de générer des courbes d’étalonnage indépendantes pour chaque expérience et dans l’expérience, pour chaque échantillon de donneur, puisque lorsque les courbes d’étalonnage ont été moyennées ensemble, des valeurs de ratio pHsens/Phines plus élevées ont été trouvées dans les cultures des FC , ce qui indique un pH plus acide (figure 3C). Figure 2: optimisation du calibrage du pH in vitro. Différents volumes de solutions de pH connu et contenant différentes concentrations de colorant ont été chargés sur une plaque de puits 96 et la fluorescence a été enregistrée plus de 1 h. effet du volume (a) et delaconcentration de colorant (B) sur les rapports de fluorescence. Les ratios ont été tracés contre le pH pour le point de temps 24 min. (C) la pente du changement de fluorescence a été calculée pour chaque solution et tracée en fonction du temps (en min). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3: optimisation de l’analyse de l’étalonnage du pH sur les hAECs primaires in situ. A) des traces représentatives de pH ASL obtenues à partir d’une seule courbe normalisée de données provenant de cultures non-CF et cf. Bdes traces représentatives de pH ASL obtenues à partir d’une courbe standard indépendante effectuée sur des cultures non CF ou cf. Chaque jeu de données a été calculé à partir de sa propre courbe d’étalonnage. Cévaluation des différences de pH ASL entre les cultures non-CF et celles des FC en fonction de la façon dont l’étalonnage a été effectué. Les données représentent la moyenne ± SEM des expériences n = 3, l’ANOVA à 2 voies, le test de comparaisons multiples de Sidak). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Afin de valider davantage notre technique, nous avons alors exigé un contrôle positif pour démontrer que la technique était capable de détecter un changement «attendu» du pH ASL. Comme la présence d’une ASL plus acide dans les cellules des FC est toujours controversée, nous avons utilisé la forskoline agoniste camp, comme une condition de contrôle positif, pour stimuler la sécrétion de HCO3 par CFTR. Les résultats escomptés montreraient une alcalinisation induite par la forskoline de l’ASL dans les cellules non-CF qui seraient en grande partie diminuées ou abolies dans les cellules des FC en fonction de la sévérité des mutations. La figure 4a montre les traces représentatives de pH ASL des cellules non-CF et CF au fil du temps et la figure 4b montre les données moyennes du pH ASL avant et après le traitement par la forskoline dans les deux types de cellules. Nous pouvons obtenir des informations différentes de ces résultats. Premièrement, comme on l’a déjà montré dans la figure 3B, C, le pH de l’ASL au repos n’était pas différent entre les épithélie non-CF et cf. Deuxièmement, le premier 3-4 points de temps après la pause de l’expérience pour traiter les cellules avec la forskoline, a montré une forte augmentation du pH qui a récupéré dans ~ 15 min. Ceci est dû à la baisse de la concentration de CO2 entre le lecteur de plaques (5%) et l’armoire de sécurité de la culture tissulaire (~ 0%). Selon l’équation d’Henderson Hasselbalch, un pH de 7 dans un environnement co2 de 5% équivaut à une concentration de HCO3- de ~ 9,3 mm. Lorsque les cellules sont retirées du lecteur de plaques, une baisse de la concentration de CO2 à 0% entraînera théoriquement une augmentation du pH de > 8. La figure 4a montre que le pH ASL a augmenté à ~ 7,8, ce qui peut s’expliquer par le laps de temps repositionnant la plaque dans le lecteur de plaque (c.-à-d. dans un environnement de 5% co2 ). Enfin, comme prévu, l’addition de 10 μM de forskoline (FSK) basolatéral a augmenté significativement le pH ASL dans les cultures non-CF seulement. Comme il a été démontré par différents groupes qu’il existe une différence dans le pH de l’ASL à l’état d’équilibre entre les épithénies des FC et des non-CF, nous voulions étudier plus avant l’absence apparente d’une différence de pH dans nos expériences et le rôle du CFTR. Pour ce faire, nous avons préincubé des cultures non-CF avec l’inhibiteur spécifique du CFTR, CFTRinh172 (172). Comme indiqué dans la section 2,8 du protocole, le mélange de colorants a été préparé comme indiqué ci-dessus et l’inhibiteur a été ajouté à une concentration de 0,1 X = 2 μM. Selon la littérature, la hauteur ASL des cellules non-CF est d’environ 10 μM. Dans un support semi-perméable de 6,5 mm de diamètre, le volume théorique de l’ASL est donc π × 3,252 = 0,3 μl. En ajoutant 3 μL de colorant + 172 à 2 μM, la concentration de l’inhibiteur, après absorption du liquide excédentaire, sera théoriquement de 20 μM (1x, concentration souhaitée). Les traces représentatives dans la figure 4C et le résumé moyen de la figure 4D montrent que le 172 n’a pas réduit le pH de l’ASL au repos mais a empêché l’augmentation du pH ASL induite par la forskoline, confirmant ainsi nos résultats obtenus de non-CF versus cf des cultures et de valider davantage notre technique. Figure 4: mesure dynamique du pH ASL en réponse à l’activation du CFTR par la forskoline. A) des traces représentatives de l’effet de la forskoline (FSK, 10 μM) sur la cinétique du pH de l’ASL dans le temps dans les haecs non-CF et cf. Les données représentent la moyenne ± SEM des expériences n = 3. BRésumé de l’effet de FSK sur le pH de l’ASL dans les cultures non-CF et cf. Les données représentent la moyenne ± écart-type de n = 69 cultures non-CF et 35 cultures des FC (ANOVA à 2 voies, test de comparaisons multiples de Sidak). (C) des traces représentatives de l’effet du CFTRinh172 (172, 20 μM) sur l’augmentation du pH ASL induite par le FSK dans les HAECS non-cf. Les données représentent la moyenne ± SEM des expériences n = 5. DRésumé de l’effet du 172 sur l’alcalinisation induite par le FSK de l’ASL dans les cultures non-cf. Les données représentent la moyenne ± SEM des expériences n = 5 (ANOVA à 2 voies, test de comparaisons multiples de Sidak). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Enfin, comme indiqué dans la section 6,8 du protocole, les taux d’acidification/d’alcalinisation peuvent être calculés en ajustant une régression linéaire aux points de temps initiaux après l’intervention. La figure 5A montre que la suppression de la solution basolatérale contenant du HCO3 (HCO3- KRB) et sa substitution par une solution tamponnée de HEPES, en l’absence de co2, induisent une acidification marquée de l’ASL. Ceci est cohérent avec l’absence de sécrétion de HCO3 -inhibant le SNE 3, qui permet la sécrétion constitutive de protons par ces cellules des voies respiratoires afin de réduire de façon constante le pH15, 17de l’ASL. Il est intéressant de noter que le taux initial d’acidification des cellules non-CF était significativement plus lent que les cultures des FC (figure 5B). Figure 5: changements dynamiques du pH ASL en réponse à la suppression de HCO3 . A) traces représentatives montrant l’effet de l’élimination de l’HCO3 sur la cinétique du pH ASL dans le temps dans les haecs non-CF et cf. Les taux initiaux d’acidification ont été obtenus par la pente d’une ligne droite ajustée à 7 points de temps après l’enlèvement de HCO3 . Les données représentent les moyennes ± SEM des expériences n = 6 et 7 sur les cultures non-CF et CF, respectivement. BRésumé des taux initiaux d’acidification après l’enlèvement du HCO3 . Les données représentent les moyennes ± SEM des expériences n = 6 et 7 sur les cultures non-CF et CF respectivement (test Mann-Whitney). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la mesure dynamique du pH de l’ASL dans les cellules épithéliales des voies respiratoires primaires. Les étapes critiques comprennent le lavage du mucus de la surface apicale des cellules, la mesure et la soustraction de l’arrière-plan en utilisant les mêmes paramètres que dans l’expérience, l’optimisation de la position z et le gain et l’exécution d’un étalonnage de pH in situ.

La première étape de lavage des cellules est cruciale car une épaisse couche de mucus pourrait (i) empêcher les colorants d’atteindre la couche périciliaire (PCL) et (II) retarder ou empêcher la détection des changements de fluorescence en réponse aux agonistes/inhibiteurs. Notre méthode a été développée pour étudier comment les haecs primaires modulé l’activité des transporteurs HCO3 et H+ en réponse aux agonistes. Bien qu’il soit intéressant d’étudier comment les changements dans le pH PCL se rapportent à des changements dans le pH du mucus, le développement ultérieur de ce protocole est nécessaire, y compris l’utilisation de différents poids moléculaires-dextrans pour cibler de manière différenciante les 2 couches et z-scans à travers le ASL entière.

La mesure de fond est une autre étape importante de ce protocole. La surface apicale de l’épithélium des voies respiratoires primaires entièrement différenciées est rarement complètement plane, ce qui affectera la trajectoire de la lumière et donc l’arrière-plan. S’assurer que les lectures de fond sont effectuées dans les mêmes points locaux des puits que pendant l’expérience est critique pour la reproductibilité et la stabilité des enregistrements.

L’optimisation de la position z et du gain sont des étapes nécessaires qui doivent être mis en place pour chaque concentration différente de colorant fluorescent qui sera utilisé. Cela évitera une forte variabilité inter-expérimentation. Une fois mis en place, notre dosage fournit des résultats stables et reproductibles. Une des raisons pour cela est que les colorants sont ajoutés sur la surface apicale sur les cellules dans un petit volume de liquide qui est facilement réabsorbé par l’épithélium, laissant un ASL étiqueté de façon homogène. Une autre méthode pour tacher l’ASL, qui peut être tout aussi réussie, poudre sèche utilisée ou une «suspension» dans PFC. bien que cela puisse être un gain de temps (comme les expériences sont généralement effectuées dans les 2 h), il est peu probable que les colorants secs entièrement solubilisent dans l’ASL et pourrait donc former des amas. Ainsi, différentes concentrations de colorant sensible au pH seront trouvées sur la surface des cellules épithéliales.

L’étalonnage in situ du pH est une étape importante afin d’obtenir des résultats précis et reproductibles. Comme indiqué et expliqué dans la section des résultats, les différences dans les volumes ASL affecteront le nombre de fluorescence et donc les valeurs de pH interpolées (figure 2 et figure 3). Alors que différents groupes ont déjà publié des mesures de pH ASL, une large gamme de valeurs ont été obtenues même entre différentes études publiées par le même groupe8,17. Nous croyons qu’en effectuant des étalonnages in situ, les résultats deviendront plus reproductibles. Comparé à d’autres techniques d’étalonnage du pH, qui utilisent la méthode élevée K+/nigericin (ou plusieurs ionophores) pour générer la courbe standard28,29,30, le dosage présenté ici présente l’avantage que , tant que chaque étape est effectuée dans une armoire de sécurité, les cellules utilisées pour le pH ASL peuvent être lavées, conservées et réutilisées pour d’autres expériences, à condition que les traitements effectués n’affectent pas irréversiblement les cellules épithéliales.

Le développement et l’optimisation de ce dosage ont fourni des résultats reproductibles et nous croyons que cette méthode aidera d’autres groupes avec leur mesure de pH ASL. Cependant, cette technique a également quelques limitations dues à la mise en place et le type de cellules qui sont utilisées. La surveillance du pH ASL sur une période plus longue que celle présentée ici (> 8-10 h) pourrait s’avérer difficile car un environnement à long terme à forte humidité pourrait endommager l’équipement et le fait que la plupart des lecteurs de plaques n’offrent que la possibilité d’enregistrer des lectures cinétiques sur une un certain laps de temps (typiquement 24 h). L’utilisation d’haecs primaires entièrement différenciés est cruciale dans la manière dont les différents stades de différenciation affecteront l’expression des transporteurs HCO3 et H+ . Cependant, il n’y a pratiquement aucune possibilité de contrôler avec précision le volume d’ASL dans les cellules cultivées dans des conditions de film mince. Comme indiqué dans les sections de protocole et de résultats, les changements de volume affecteront le rapport de fluorescence et il est malheureusement nécessaire de supposer que dans les cellules cultivées à partir d’une seule personne, ensemencées le même jour sur différents supports semi-perméables, les volumes ASL sera le même. En raison de cette limitation, tout agoniste ou inhibiteur qui affectera la sécrétion ou l’absorption des fluides affectera le volume ASL et vraisemblablement les rapports de fluorescence. Cependant, dans notre analyse, la courbe d’étalonnage est exécutée à la fin de l’expérience, de sorte que nous pouvons présumer que ces changements de volume affecteront les ratios d’étalonnage de la même manière que pendant l’expérience cinétique. Pour cette raison, nous conseillons aux groupes qui seraient intéressés à développer ce dosage, d’utiliser au moins 2-3 répétitions par condition testée car cela permettra l’établissement d’une courbe standard pour chaque condition.

Ici nous présentons un essai simple, semi-automatisé, qui permet la mesure en temps réel du pH de surface de la muqueuse dans des conditions de film mince. Il a la capacité d’étudier les réponses dynamiques de pH dans beaucoup de cultures d’une manière quasi-simultanée qui permet des comparaisons inter et intra-donneur. La mise à l’échelle de cette méthode à un format de plaque de puits 96 utilisant le système polarisé (plaques de puits HTS 96)38 fournirait un débit encore plus élevé comme essai de découverte de drogue. De plus, nous avons montré comment cette technique peut être utilisée pour étudier l’effet aigu des agonistes sur le pH de l’ASL et nous avons déjà publié que cette méthode peut être utilisée pour étudier l’effet à long terme d’un inhibiteur de la pompe à protons apicale sur les FC hAECs ASL39. Comme le pH a été montré pour réguler l’infection, l’inflammation, la viscosité du mucus et le transport ionique, l’identification des cibles moléculaires qui peuvent augmenter le pH sera précieuse dans les domaines de recherche des maladies pulmonaires chroniques et cette technique facilitera potentiellement la dépistage des drogues dans les approches de la médecine personnalisée. Enfin, étant donné que la dysrégulation dans l’homéostasie de base acide joue un rôle majeur dans d’autres maladies, ce protocole peut être adapté, avec des étapes d’optimisation, à différents équipements (lecteurs de plaques) et types de cellules, tels que d’autres cellules épithéliales. L’acidité extracellulaire est une caractéristique du cancer40,41,42 et ce dosage pourrait aider à déterminer comment les tumeurs solides produisent un pH faiblee ou pourraient être utilisées comme un test de dépistage de médicaments à faible débit pour rétablissement de l’homéostasie du pH. De même, comme pour les maladies chroniques des voies respiratoires, il pourrait également fournir une plate-forme pour le développement d’une approche de médecine personnalisée.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été appuyé par deux subventions du centre de recherche stratégique de la fiducie des FC (SRC003 et SRC013) et une subvention de confiance en concept (MC_PC_15030) du Conseil de recherches médicales (MRC). JG a été appuyé par une subvention de la Fondation de recherche médicale (MRF-091-0001-RG-GARNE). Le MB a été appuyé par une bourse de clinicien-chercheur du Conseil de recherche médicale (MR/M008797/1). IH a été soutenue par une bourse de formation clinique Wellcome Trust (203520/Z/16/Z). La recherche a été soutenue par l’Institut national de recherche en santé de Newcastle centre de recherche biomédicale basé à Newcastle hôpitaux NHS Foundation Trust et Newcastle University. Les points de vue exprimés sont ceux de l’auteur (s) et non pas nécessairement ceux du NHS, du NIHR ou du ministère de la santé. Les cellules primaires du Dr Randell ont été soutenues par la subvention de la Fondation de la fibrose kystique (BOUCHE15R0) et la subvention NIH (P30DK065988).

Materials

0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385
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Referências

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Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).
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