JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

Published: June 13, 2019
doi:
10.3791/59815
, , , , , ,
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children’s Hospital,Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

We presenteren een protocol om dynamische metingen van de luchtweg oppervlak vloeibare pH te maken onder dunne film voorwaarden met behulp van een plaat-lezer.

Abstract

In de afgelopen jaren is het belang van mucosale oppervlak pH in de luchtwegen is gemarkeerd door haar vermogen om te reguleren luchtweg oppervlakte vloeistof (ASL) hydratatie, slijm viscositeit en activiteit van antimicrobiële peptiden, belangrijke parameters die betrokken zijn bij ingeboren verdediging van de Longen. Dit is van primair belang op het gebied van chronische ademhalingsziekten zoals cystische fibrose (CF) waar deze parameters dysregulated zijn. Terwijl de verschillende groepen ASL pH zowel in vivo als in vitro hebben bestudeerd, rapporteren hun methodes een vrij brede waaier van ASL pH waarden en zelfs tegenstrijdige bevindingen betreffende om het even welke pH verschillen tussen niet-CF en CF cellen. Bovendien, hun protocollen niet altijd voldoende details om te zorgen voor reproduceerbaarheid, de meeste zijn lage doorvoersnelheid en vereisen dure apparatuur of gespecialiseerde kennis uit te voeren, waardoor ze moeilijk vast te stellen in de meeste Labs. Hier beschrijven we een semi-geautomatiseerde TL-plaat lezer assay die de real-time meting van de ASL pH in staat stelt onder dunne film voorwaarden die meer lijkt op de in vivo situatie. Deze techniek zorgt voor een stabiele metingen voor vele uren van meerdere luchtweg culturen tegelijk en, belangrijker, dynamische veranderingen in de ASL pH in reactie op agonisten en remmers kunnen worden gecontroleerd. Om dit te bereiken, de ASL van volledig gedifferentieerde primaire menselijke luchtweg epitheelcellen (hAECs) zijn ‘s nachts gekleurd met een pH-gevoelige kleurstof om te zorgen voor de heropname van de overtollige vloeistof om dunne film voorwaarden te garanderen. Nadat de fluorescentie in aanwezigheid of afwezigheid van agonisten wordt bewaakt, wordt pH kalibratie in situ uitgevoerd om de volume-en kleurstof concentratie te corrigeren. De beschreven methode biedt de vereiste controles om stabiele en reproduceerbare ASL pH metingen, die uiteindelijk kunnen worden gebruikt als een Drug Discovery platform voor gepersonaliseerde geneeskunde te maken, evenals aangepast aan andere epitheelweefsels en experimentele voorwaarden, zoals inflammatoire en/of host-pathogeen modellen.

Introduction

De luchtweg epitheel wordt gedekt door een dunne (~ 10 μm) vloeibare laag genoemd de luchtweg oppervlakte vloeistof (ASL). De samenstelling en diepte (hydratatie) van deze ASL is strak gereguleerd en regelt de efficiëntie van de luchtwegen ontruiming door de mucociliary roltrap1,2,3,4. In de afgelopen jaren, het belang van de ASL H+/HCO3– inhoud is aangetoond door verschillende groepen te wijten aan de mogelijkheid om ASL hydratatie te reguleren5, luchtwegontsteking6 en infectie7, 8 evenals slijm viscositeit8,9. Belangrijk, hoewel er sommige controversen bestaat, hebben vele studies ontregeling van de luchtweg pH bij chronische luchtweg ziekten zoals astma10,11,12, COPD11gemeld, Bronchiëctasieën11, chronische rhinosinusitis13,14 en Cystic Fibrosis (CF)5,9,15,16,17, die suggereert dat therapieën die te herstellen ASL pH nuttig kan zijn om meerdere vormen van chronische luchtwegaandoeningen te behandelen. CF is de meest voorkomende autosomaal recessieve genetische ziekte in Kaukasische populaties en is te wijten aan mutaties in de CF transmembraan geleidings regulator (CFTR) gen. Dit gen codeert een anion (HCO3– en cl–) kanaal dat een cruciale rol speelt in ion en Fluid transport en homeostase over epitheel18. Hoewel CF is een multi-orgaan ziekte, de Long pathologie is de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit19,20 en gezien het primaire defect in CF is een verminderde transport van cl– en HCO3–, Men kan veronderstellen dat extracellulaire vloeistof pH bij mensen met CF zal worden dysregulated in vergelijking met mensen die niet hebben CF. zo is de meting van de ASL pH is een actueel gebied van CF onderzoek en verschillende groepen hebben ontwikkeld technieken om ASL pH te meten in CF Airways.

In vivo, luchtweg pH is gemeten met behulp van verschillende technieken, van micro-sondes (Fiber-Optic, goud of mobidium sondes)5,21,22,23,24 tot pH metingen van expectorated materiaal of uitgeademd adem condensaat (EBC)10,11,12,25,26,27. Op het gebied van onderzoek van CF, pH wordt op grote schaal bestudeerd vanwege de mogelijke klinische implicaties. Theoretisch, waardoor de luchtwegen meer alkalische zou kunnen verhogen bacteriële doden en verbeteren mucociliary klaring en luchtweg homeostase als geheel. Echter, in vivo/ex vivo studies rapporteren een breed scala van pH-waarden, en tot op heden, de resultaten zijn niet overtuigend met betrekking tot het bestaan van een verschil in pH tussen niet-CF en CF Airways. In het begin van de jaren 2000 rapporteerden verschillende groepen de pH van de EBC. In niet-zieke groepen, pH-waarden varieerde van 4,6 tot 8,5, maar interessant, EBC pH werd gevonden zuurder tijdens verergeringen bij mensen met CF12,27. Meer recentelijk, in vivo metingen van de ASL in menselijke en dierlijke modellen van CF hebben gemeld tegenstrijdige resultaten16,17,21,22,23, 24 en het is nog onduidelijk of CF Airways zijn zuurder dan niet-CF luchtwegen.

Zoals in vivo meting van de lagere ASL pH heeft bewezen moeilijk te wijten aan de zeer kleine hoeveelheid vloeistof voering van de luchtwegen en de mogelijke aanwezigheid van slijm pluggen in de ziekte, hebben veel groepen zich tot in vitro experimenten te meten ASL pH, voornamelijk met behulp van drie verschillende Methoden. De eerste aanpak maakt gebruik van dextran-gekoppelde cel-impermeant pH-gevoelige fluorescerende kleurstoffen die worden toegevoegd als een droog poeder, hetzij rechtstreeks aan de ASL of met behulp van een inerte vloeistof genaamd perfluorocarbon (PFC)5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. deze techniek geeft echter weinig controle over de exacte hoeveelheid kleurstof die aan de culturen wordt toegevoegd en geeft een risico van kleurstof aggregaten en grote verschillen in concentratie tussen monsters en/of experimenten en zelfs binnen hetzelfde monster . Het is ook in het algemeen uitgevoerd met een confocale Microscoop, die de toepasbaarheid beperkt en in veel gevallen, voorkomt gedetailleerde monitoring van meerdere monsters en veranderingen in de opname-omstandigheden. De tweede methode gebruikt om te meten ASL pH is het gebruik van pH-gevoelige micro-elektroden5,15. ASL pH metingen zijn dus niet afhankelijk van fluorescerende kleurstof concentratie en moeten meer robuuste en reproduceerbare resultaten geven. Echter, deze methode niet mogelijk voor dynamische, real-time metingen van de ASL pH, noch is het gemakkelijk om meerdere lezingen te maken onder verschillende omstandigheden. Het is ook een arbeidsintensieve, complexe, proces dat specialistische apparatuur (microelektrode fabricage/elektrofysiologische opnameapparaten) en opleiding voor het verzamelen van de monsters voor de daaropvolgende pH-meting en kalibratie vereist. Bovendien hebben deze twee technieken ook een aantal inconsistenties getoond in de mogelijkheid om reproduceerbare resultaten te produceren: met behulp van de pH-gevoelige fluorescerende kleurstof methode, Tang et al. gerapporteerde waarden van 7,35 voor niet-CF ASL en 7,0 voor CF ASL8 overwegende dat in een meer recent papier uit dezelfde groep, ASL pH was 6,9 en 6,4 voor niet-CF en CF, respectievelijk17. Op een gelijkaardige manier, gaven de microelektrode metingen waarden van 6,4 in niet-CF ASL en 6,1 in CF ASL in een studie van 200315 terwijl de zelfde groep waarden van 6,7 voor niet-CF asl en 6,45 voor CF ASL in een studie van 20135rapporteerde. Ten slotte, in de derde benadering, onderzoekers voegen een relatief groot volume van zwak gebufferde oplossing op de apicale (mucosale) oppervlak van de culturen, waardoor de vernietiging van dunne film voorwaarden en het veranderen van ASL samenstelling, en mogelijk haar regelgeving. pH wordt vervolgens gemeten, hetzij met behulp van pH-gevoelige fluorescerende kleurstoffen33, door een pH-stat titratiemethode in een Ussing kamer13,14, of vereist de verdunde ASL te worden verwijderd uit de culturen en pH gemeten met behulp van een pH elektrode, analysator of Lakmoes stroken34. Een andere moeilijkheid in de nauwkeurige meting van ASL pH is de oprichting van een standaardkromme die zo nauwkeurig mogelijk is. Inderdaad, of de lezingen worden uitgevoerd met een elektrode die het verschil in elektrisch potentieel te meten via een hars of met behulp van pH-gevoelige fluorescerende kleurstoffen, zullen beide benaderingen worden beïnvloed door de lokale microomgeving van de monsters worden Gemeten. Meer in het bijzonder, de dissociatieconstante (KD) van de kleurstoffen kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van de temperatuur, Ionische sterkte, viscositeit en mogelijke interacties van de kleurstof met cellulaire bestanddelen zoals eiwitten en potentieel slijm.

Om te proberen en te overwinnen veel van deze technische problemen, evenals de ontwikkeling van een meer dynamische, eenvoudiger en hogere doorvoersnelheid methode, hebben we een in vitro-techniek die records ASL pH in primaire hAEC culturen met behulp van een cel-impermeant pH-gevoelige fluorescerende kleurstof in een standaard commerciële plaat-lezer. De methode genereert reproduceerbare, dynamische, semi-geautomatiseerde, real-time metingen van de ASL pH van volledig gedifferentieerde 3D-cel culturen onder dunne film omstandigheden. Door het gebruik van een Multiple-well plaat lezer, kan deze semi-geautomatiseerde assay te maken in de buurt gelijktijdige metingen van de pH voor maximaal 24 voorwaarden meer dan 12 uur en kan het effect van het toevoegen van verschillende agonisten of remmers te controleren. In deze paper beschrijven we de methodologie in detail en rapporteren representatieve resultaten onder positieve en negatieve controle voorwaarden die de techniek valideert.

Protocol

Primaire niet-CF (n = 3 donoren, leeftijd 34, 27 en 23 jaar oud) en CF (n = 3 donateurs, alle F580del/F508del; leeftijd 40, 41, onbekend) hAECs waren een vriendelijke gift van Dr. Scott H. (het Instituut van de Long van Marsico, de Universiteit van Noord-Carolina bij Chapel heuvel, Verenigde Staten) en waren obtai Ned onder Protocol #03-1396 goedgekeurd door de Universiteit van North Carolina op Chapel Hill biomedische Institutional Review Board. De cellen werden geteeld volgens eerder gepubliceerde methoden met behulp van de groei en differentiatie media beschreven door Fulcher en35,36. 1. monstervoorbereiding Grow primaire hAECs op 6,5 mm diameter semi-doorlaatbare ondersteunt (tabel van materialen) op lucht-Liquid interface voor ten minste 28 dagen, zoals eerder beschreven35,36. Bereid 50 ml steriele oplossing van HCO3- bevattende Krebs-bufferoplossing (HCO3- krb, concentraties worden gegeven in mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl2 (1), MgCl2 (1), D-glucose (5)) en filter-steriliseren met behulp van een 0,2 μm spuit filter. Verander de basolaterale medium tot Fresh differentiatie medium zoals beschreven in 1,135,36.Nota: men heeft aangetoond dat de basolaterale glucoseconcentratie ASL pH33beïnvloedt. In dit stadium kan het glucosegehalte van het basolaterale compartiment worden gecontroleerd door het medium te vervangen door gebufferde oplossingen van bekende glucose concentraties. Was het apicale oppervlak van de cellen door toevoeging van 150 µ l van HCO3- krb en incubeer voor 20 min bij 37 °c, 5% Co2. Verwijder de apicale Wash zonder verstoring van het epitheel door opzuigen het zorgvuldig met behulp van een steriel glas Pasteur pipet en een steriele P200 pipet Tip gekoppeld aan een aspiratie pomp die een vacuüm in de collectie fles creëert. In dit stadium, moet er zo weinig vloeistof blijven op het apicale oppervlak mogelijk om de lucht-vloeibare interface te herstellen. Incubeer de cellen voor een verdere 30 min bij 37 °C, 5% CO2. 2. achtergrond meting Schakel de plaat lezer en de computer in. Open het dashboard. Klik op Spark 10m, open de temperatuur controle en ingesteld op 37 ° c. Open de gas-controle en stel de CO2 tot 5%. Wacht tot de temperatuur en CO2 hebben hun doelen bereikt. Open de plaat lezer lade, plaats de vocht cassette gevuld met 6 mL dH2O aan elke kant. Zorg ervoor dat het deksel en de onderkant van de plaat schoon zijn-zo niet, schoon met 70% van de ethanol op een stuk weefsel-en plaats de plaat in de luchtvochtigheid cassette.Opmerking: gedurende het experiment, de weefselkweek plaat deksel wordt gehouden op de plaat en alleen verwijderd bij het toevoegen van drugs of het veranderen van de basolaterale medium, die worden uitgevoerd in een weefselcultuur laminaire stroming kap om de culturen te houden in een steriele omgeving. Open de Spark Method Editor en stel de parameters op de software als volgt in: Selecteer de juiste plaat sjabloon (voor 6,5 mm diameter semi-doorlaatbare ondersteunt, selecteert u de 24 goed plaat) en de putten die zullen worden gecontroleerd tijdens dit experiment. Voeg een temperatuur en CO2 bedieningspaneel en zet ze op 37 ° c en 5%, respectievelijk. Vink de wachttijd voor temperatuur/gas dozen. Voeg een kinetische lus paneel en selecteer de duur als de lus type en stel deze in op 5-10 min. Kies niet gedefinieerd als het interval type om continu lezen in te schakelen.Nota: de timing van het ononderbroken lezen hangt van het aantal putten/de voorwaarden af. 5 min is lang genoeg voor 6-12 putten terwijl een volledige plaat die 24 voorwaarden bevat 10 min van ononderbroken metingen zal vereisen. Binnen de kinetische lus, Voeg twee “fluorescentie intensiteit” panelen, met behulp van de drag and drop functie, die zal worden ingesteld voor de pH-gevoelige en de pH ongevoelig fluorescerende kleurstoffen respectievelijk. Stel excitatie en emissie golflengten tot 560 en 590 nm, respectievelijk voor de pH-gevoelige kleurstof en 495 en 520 nm, respectievelijk voor de pH-ongevoelig kleurstof. Stel het aantal flitsen op 30 en de z-positie tot 33200 voor elke fluorophore.Opmerking: de z-positie en gain instellingen zijn afhankelijk van de kenmerken van de plaat lezer. Stel de winst handmatig in op een waarde die hoog genoeg telt, zodat de verschillen tussen de monsters worden opgehaald, maar laag genoeg, zodat de toevoeging van een agonist niet zal genereren waarden uit het bereik van de detectie. Stel de meervoudige lezen per well naar de gebruiker gedefinieerd als een cirkel type van 3 × 3 formaat met een rand van 4750 µm. Klik op de startknop om een achtergrond meting te maken en OK om het deksel van de luchtvochtigheid cassette te bevestigen is op zijn plaats. Aan het einde van de meting, open de plaat lezer lade, neem de plaat uit en Pplace de cellsit terug in de incubator tijdens de voorbereiding van de fluorescente Dye mix oplossing. Bereid de fluorescente kleurstof mengelings oplossing door 2 µ l van 1 mg/ml dextran-gekoppelde pH-gevoelige (pHsens) fluorescente kleurstof toe te voegen aan 0,2 µ l van 10 mg/ml dextran-gekoppelde pH-ongevoelig (pHins) fluorescerende kleurstof en 0,8 µ l van steriele HCO3- krb voor een finale volume van 3 µ L per voorwaarde.Opmerking: het totale volume van de kleurstof mix oplossing moet worden voorbereid voor n Wells + 1 als er tussen de 1 en 10 monsters, of n Wells + 2 als er tussen de 11 en 24 monsters. Dextran-gekoppelde kleurstoffen worden opnieuw samengesteld in gefilterde-steriele HCO3- krb oplossing, gepaard en opgeslagen bij-20 °c. Elke chemische stof kan worden toegevoegd in dit stadium voor een 16-24 h incubatietijd37 op het apicale oppervlak. Chemicaliën moeten worden bereid als 0,1 x, als het uiteindelijke volume, na absorptie van de overtollige vloeistof door de cultuur, zal rond 0,3 µ L voor een 6,5 mm diameter semi-doorlaatbare ondersteuning. Voeg voorzichtig 3 µ L kleurstof mix (zie 2,8) toe aan het apicale oppervlak van de cellen en broed in een nacht bij 37 °C, 5% CO2. 3. kinetische meting Herhaal stap 2,1 tot 2,4 om de plaat lezer voor te bereiden. Klik op het pictogram openen en selecteer het methode bestand dat wordt gebruikt voor de achtergrondmetingen In de Kinetic loop paneel, houd de lus type als duur en zet deze op 08 uur. Wijzig het interval type in vast en stel het in op 5 minuten. Houd de fluorescentie-intensiteits panelen hetzelfde als voor de achtergrondmetingenOpmerking: interval type voor achtergrondmetingen is ingesteld op “niet gedefinieerd” om continu te kunnen lezen. Voor kinetische en kalibratie-experimenten, is het IntervalType ingesteld op “Fixed” met een interval van 5 min. Dit kan worden aangepast op basis van het ontwerp van het experiment en het aantal voorwaarden. Open de lade van de plaat lezer; plaats de vocht cassette gevuld met 6 mL dH2O aan elke kant. Zorg ervoor dat het deksel en de onderkant van de plaat schoon zijn-zo niet, schoon met 70% ethanol op een stuk weefsel-en plaats de plaat in de luchtvochtigheid cassette, met zijn deksel. Start fluorescentie lezingen door te klikken op Start. Klik op OK nadat u hebt verzekerd dat het deksel van de vochtigheids cassette op zijn plaats is. Na n cycli, meestal tussen de 12 en 24, die gelijk is aan 1 tot 2 uur, klikt u op onderbreken om het experiment te onderbreken. Neem de plaat uit en breng alle drugs/agonisten basolaterally aan de verschillende monsters.Opmerking: wanneer de cellen worden genomen uit de plaat lezer, CO2 ontsnapt en dit zal leiden tot een toename van de ASL pH, zoals blijkt uit een daling van de pH-gevoelige kleurstof fluorescentie. Deze CO2-geïnduceerde pH-verandering keert binnen 10-15 min na het plaatsen van de culturen terug in de plaat lezer. Zet de plaat terug in de luchtvochtigheid cassette op de lade, de positie van de luchtvochtigheid cassette deksel en klik op Doorgaan om verder record ASL pH en monitor het effect van de drugs/agonisten op ASL pH. 4. in situ pH kalibratie Neem de plaat uit de plaat lezer. Aspireren het basolaterale medium/oplossing. Voeg 750 µ L en 1 µ L van zeer gebufferde standaardkromme oplossingen toe aan het basolaterale compartiment en het apicale oppervlak, respectievelijk.Nota: de hoogst gebufferde standaardkromme oplossingen bevatten (in mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), MgCl2 (1,2), NaHEPES of MES of tris (100 mm). Gebruik MES om oplossingen te bufferen met een pH lager dan 7, NaHEPES voor oplossingen van pH 7-7.5 en tris voor oplossing met pH 8. Klem de pH op de gewenste waarde met HCl. Schakel de CO2 uit op de plaat lezer of zet deze op 0,1% en plaats de plaat terug in de luchtvochtigheid cassette. Stel de plaat lezer met dezelfde parameters zoals eerder beschreven, maar met geen CO2 als in stap 3,2. Begin fluorescentie lezingen, elke 5 min voor 1-1.5 h. 5. evaluatie van het effect van kleurstof concentratie en suspensie volume op kalibratie gegevens Bereid voldoende pH-gevoelige en ongevoelig kleurstof mengsel om de fluorescentie op te nemen op een minimum van 4 verschillende pH-waarden in 3 verschillende volumes.Opmerking: hier, meng 1 werd bereid met 26 µ L pH-gevoelig (1 mg/mL) en 2,6 µ L van pH-ongevoelig (10 mg/mL) en Meng 2 met 13 µ L pH-gevoelig (1 mg/mL) en 1,3 µ L pH-ongevoelig (10 mg/mL). Verdeel 2,2 µ L of 1,1 µ L van mengeling 1 of mengeling 2, respectievelijk in 12 putten van een 96 goed plaat en voeg genoeg kaliber bepalings oplossingen toe om definitieve volumes van 50, 100 of 200 µ L te verkrijgen en goed te mengen.Opmerking: in deze set-up worden fluorescentie tellingen opgenomen voor concentraties van kleurstoffen van 5 µ g/mL (in 200 µ L); 10 µ g/mL (in 100 of 200 µ L), 20 µ g/mL (in 50 of 100 µ L) of 40 µ g/mL (in 50 µ L). Draai de plaat lezer op, zet de temperatuur op 37 ° c en plaats de plaat in de plaat lezer. Draai de CO2 -controller niet aan.Nota: aangezien dit een kort experiment is en slechts genoeg tijd vergt om de temperatuur te equilibrate, is de vochtigheids cassette niet vereist. Stel de z-positie en de winst voor de 96 goed plaat en gebruik dezelfde parameters als voor het experiment gedaan op semi-doorlaatbaar ondersteunt. 6. gegevensanalyse Sla alle gegevens op in spreadsheets en maak een nieuw bestand. In de achtergrondbestand, selecteert u alle gemiddelde gegevens voor elk monster/voorwaarde voor beide golflengten, kopiëren en plakken naar het nieuwe bestand. Bereken de gemiddelde achtergrond voor elk goed en elke golflengte. Herhaal dit met de kalibratie en kinetische gegevens en aftrekken van de achtergrond van elk gegevenspunt voor elke golflengte. Bereken voor elk tijdpunt en elk monster de verhouding tussen pH-gevoelige en pH-ongevoelig fluorescentie Als alle monsters zijn verkregen van een individuele donor, bereken het gemiddelde van de ratio’s op elk moment punt van de kalibratiecurveNota: het is belangrijk om zo vele kaliber bepalings krommen als donor of basolaterale oplossingen te produceren. Inderdaad, deze parameters kunnen invloed hebben op de achtergrond lezingen of de snelheid van de absorptie van de vloeistof, die op zijn beurt zal de kleurstof concentratie beïnvloeden en dus de berekende pH. Voor elke tijdpunt, het genereren van een standaard curve van de ratio’s, plotten de bekende pH-waarden op de x-as en de ratio’s op de y-as. Bepaal het tijdstip waarop verhoudingen stabiel zijn, past een lineaire regressielijn en het verkrijgen van de vergelijking voor deze lijn. Van de kinetische gegevens, bereken de pH voor elke tijdpunt en perceel de pH op de y-as en de tijd op de x-asOpmerking: rust/basale pH kan worden berekend door middel van gegevenspunten over de stabiele meting van de pH voor de toevoeging van een agonist of een andere interventie. Het effect van een agonist kan worden gekenmerkt door het berekenen van het verschil in pH voor en na (een bepaalde hoeveelheid tijd) de behandeling of door het monteren van een niet-lineaire kromme aan de gegevenspunten direct na de interventie. Dit zal extra informatie geven over de t1/2 en de maximale waarde. Ten slotte kunnen de tarieven van de verzuring of alkalinization ook worden verkregen uit de helling van een rechte lijn gemonteerd op de eerste punten na de interventie.

Representative Results

De hierboven beschreven techniek maakt de dynamische meting van de ASL pH in maximaal 24 afzonderlijke primaire hAECs culturen mogelijk. Figuur 1 toont een schematische weergave van de belangrijkste stappen en apparatuur opgezet. De ‘s nachts geladen cellen worden geplaatst in een CO2 en temperatuur gecontroleerde plaat lezer waarin fluorescentie van dextran-gekoppelde pH-gevoelige en pH-ongevoelig kleurstoffen worden geregistreerd om de 5 minuten. Figuur 1: schematische van de ASL pH meetmethode. Na het wassen van de culturen en het uitvoeren van een achtergrond lezen, primaire menselijke luchtweg epitheelcellen (hAECs) ASL zijn geladen met dextran gekoppeld pH-gevoelige en pH-ongevoelig kleurstof mengsel overnachting bij 37 ° c, 5% CO2. De volgende dag, de plaat wordt overgebracht naar een temperatuur en CO2-gecontroleerde plaat lezer en fluorescentie van beide kleurstoffen wordt geregistreerd in de tijd. Na het experiment, een in situ kalibratie wordt uitgevoerd en de gegevens geanalyseerd en gepresenteerd als ASL pH in de tijd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Eerst onderzochten we het effect van verschillende volumes en kleurstof concentraties op de fluorescentie tellingen en dus op de 560/495 ratio. Inderdaad, het doel van het toevoegen van de pH-ongevoelig voor de pH-gevoelige kleurstof is te corrigeren voor de variabiliteit in de ASL laden. Nochtans, was het belangrijk om deze veronderstelling te testen en te evalueren als wij een standaard kaliberbepalingskromme konden gebruiken die in de afwezigheid van cellen in een 96 goed plaat voor alle experimenten en cel types wordt uitgevoerd. We bewaakten fluorescentie telt meer dan 1 uur in 50, 100 of 200 µ l van kalibratie oplossingen (bij pH 5,5, 6,5, 7 of 8) met 5, 10, 20 of 40 µ g/mL kleurstoffen. De resultaten worden gepresenteerd in Figuur 2a-C, en laten zien dat voor dezelfde pH en dezelfde concentratie van kleurstoffen, de gerapporteerde pHsens/pHins emissie ratio (560/495 op de y-as) verschilde afhankelijk van het volume (Figuur 2a). Bovendien, op dezelfde pH en hetzelfde volume, verschillende kleurstof concentraties bieden verschillende ratio waarden (Figuur 2b). Daarom, veranderingen in volume of kleurstof concentratie zal invloed hebben op de absolute waarde van de pH berekend op basis van de emissie ratio. Figuur 2c laat zien dat de tijd die nodig is voor de temperatuur evenwicht is ongeveer 15-20 min. Ter bevestiging van het effect van de kleurstof concentratie en het volume op de emissie ratio’s, hebben we fluorescentie opgenomen van kleurstoffen geladen in de ASL van de primaire niet-CF en CF hAECs in situ. Vervolgens hebben we de kalibratie uitgevoerd en analyseerden de resultaten door (1) het genereren van een wereldwijde standaard curve van alle monsters of (2) het genereren van twee onafhankelijke standaard bochten voor elk type cel (niet-CF en CF). ASL pH van beide soorten cellen werden vervolgens uitgezet tegen de tijd (Figuur 3a, B) en gemiddeld (figuur 3c). ASL pH waarden verkregen uit een enkele wereldwijde standaard curve toonde een significant verschil tussen niet-CF-en CF-culturen (Figuur 3a, C),terwijl de ASL pH niet significant verschilde tussen CF en non-CF hAECs toen de pH werd berekend uit onafhankelijke standaard krommen (Figuur 3b, C). Deze resultaten tonen het belang van het genereren van onafhankelijke kalibratie bochten voor elk experiment en binnen experiment, voor elke donor monster, sinds wanneer de kalibratie bochten werden samen gemiddeld, hogere pHsens/pHins ratio waarden werden gevonden in CF-culturen , met vermelding van een zuurder pH (figuur 3c). Figuur 2: optimalisering van de pH kalibratie in vitro. De verschillende volumes van oplossingen van bekende pH en het bevatten van verschillende kleurstof concentraties werden geladen op een 96 goed plaat en de fluorescentie werd geregistreerd meer dan 1 h. effect van volume (a) en de concentratie vandekleurstof (B) op fluorescentie verhoudingen. Ratio’s werden uitgezet tegen de pH voor de tijd-punt 24 min. (C) de helling van de verandering in fluorescentie werd berekend voor elke oplossing en uitgezet als een functie van de tijd (in min). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: optimalisering van de analyse van de pH kalibratie op primaire hAECs in situ. (A) representatieve sporen van ASL pH verkregen uit één enkele standaardkromme die gegevens van niet-CF-en CF-culturen gemiddeld. (B) representatieve sporen van ASL pH verkregen uit onafhankelijke standaard curve uitgevoerd op niet-CF-of CF-culturen. Elke gegevensset werd berekend op basis van zijn eigen kalibratiecurve. (C) evaluatie van de verschillen in ASL pH tussen non-CF en CF culturen als een functie van hoe de kalibratie werd uitgevoerd. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 3 experimenten, 2-weg ANOVA, Monica meerdere vergelijkingen test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Om onze techniek verder te valideren, hadden we een positieve controle nodig om aan te tonen dat de techniek in staat was om een ‘ verwachte ‘ verandering in ASL pH te detecteren. Aangezien de aanwezigheid van een meer zure ASL in CF-cellen is nog steeds controversieel, gebruikten we de camping agonist Forskolin, als een positieve controle voorwaarde, te stimuleren HCO3- secretie door middel van CFTR. Verwachte resultaten zou een Forskolin-geïnduceerde gealkaliseerd van de ASL in niet-CF-cellen die grotendeels zou worden verlaagd of afgeschaft in CF-cellen, afhankelijk van de ernst van de mutaties. Figuur 4a toont representatieve sporen van de ASL pH van niet-CF-en CF-cellen in de tijd en figuur 4b toont de gemiddelde gegevens van de ASL pH voor en na de behandeling met Forskolin in beide typen cellen. We kunnen verschillende informatie krijgen van deze resultaten. In de eerste plaats, zoals reeds getoond in Figuur 3b, C, de rust ASL pH was niet anders tussen niet-CF en CF epitheel. Ten tweede, de eerste 3-4 tijd-punten na het onderbreken van het experiment om de cellen met Forskolin te behandelen, toonde een grote verhoging van pH die binnen ~ 15 min. terugkreeg. Dit was te wijten aan de daling in CO2 concentratie tussen de plaat lezer (5%) en het weefselcultuur veiligheidskabinet (~ 0%). Volgens de Henderson Hasselbalch vergelijking, een pH van 7 in een 5% Co2 omgeving komt overeen met een concentratie van HCO3- van ~ 9,3 mm. Wanneer de cellen worden verwijderd uit de plaat lezer, een daling in CO2 concentratie op 0% zal theoretisch leiden tot een verhoging van de pH van > 8. Figuur 4a toont aan dat ASL pH verhoogd tot ~ 7,8, die kan worden verklaard door het verstrijken van de tijd herpositionering van de plaat in de plaat lezer (dat wil zeggen, in een 5% Co2 omgeving). Ten slotte, zoals voorspeld, toevoeging van basolaterale 10 µ M Forskolin (FSK) significant toegenomen ASL pH in niet-CF-culturen alleen. Zoals het is aangetoond door verschillende groepen dat er een verschil in steady-state ASL pH bestaat tussen CF en non-CF epitheel, wilden we verder onderzoek naar de schijnbare afwezigheid van een pH verschil in onze experimenten en de rol van CFTR. Om dit te doen hebben we pre-incubatie non-CF culturen met de specifieke CFTR remmer, CFTRinh172 (172). Zoals vermeld in het protocol sectie 2,8, de kleurstof mix werd voorbereid zoals hierboven vermeld en de remmer werd toegevoegd bij een concentratie van 0,1 X = 2 µ M. Volgens de literatuur, ASL hoogte van niet-CF-cellen is ongeveer 10 µm. In een semi-doorlaat steun van 6,5 mm diameter, is het theoretische volume van de ASL dus π × 3,252 = 0,3 µ l. Door toevoeging van 3 µ L van Dye + 172 op 2 µ M, zal de concentratie van de inhibitor, na absorptie van de overtollige vloeistof, theoretisch 20 µ M (1x, gewenste concentratie) zijn. Representatieve sporen in figuur 4c en gemiddelde samenvatting in figuur 4D laten zien dat 172 niet verminderen rusten ASL pH, maar heeft voorkomen dat de Forskolin-geïnduceerde stijging van de ASL pH, dus bevestiging van onze resultaten verkregen uit niet-CF versus CF en verder valideren van onze techniek. Figuur 4: dynamische ASL pH meting in reactie op CFTR activering door Forskolin. (A) representatieve sporen van het effect van Forskolin (FSK, 10 µ m) op de KINETIEK van ASL pH na verloop van tijd in niet-CF en CF hAECs. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 3 experimenten. (B) samenvatting van het effect van FSK op ASL pH in niet-CF-en CF-culturen. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van n = 69 non-CF culturen en 35 CF culturen (2-weg ANOVA, Monica meerdere vergelijkingen test). Crepresentatieve sporen van het effect van CFTRinh172 (172, 20 µ m) op de door FSK geïnduceerde toename van de ASL pH in niet-CF-hAECs. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 5 experimenten. (D) samenvatting van het effect van 172 op FSK-geïnduceerde gealkaliseerd van de ASL in niet-CF-culturen. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 5 experimenten (2-weg ANOVA, Monica meerdere vergelijkingen test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Ten slotte, zoals vermeld in het protocol sectie 6,8, kunnen de tarieven van de verzuring/alkalinization worden berekend door een lineaire regressie te monteren op de initiële tijdpunten na de interventie. Figuur 5a toont aan dat het verwijderen van de basolaterale HCO3- bevattende oplossing (HCO3- krb) en vervangen door een Hepes Buffered oplossing, bij afwezigheid van co2, een duidelijke verzuring van de ASL veroorzaakte. Dit is in overeenstemming met het ontbreken van HCO3- remmende transepitheel HCO3- secretie, die het mogelijk maakt constitutieve Proton secretie door deze luchtweg cellen om gestaag te verminderen ASL pH15, 17. Interessant is dat de aanvankelijke verzuring van niet-CF-cellen beduidend langzamer was dan de CF-culturen (Figuur 5b). Figuur 5: dynamische veranderingen in de ASL pH in reactie op HCO3- verwijdering. (A) representatieve sporen waaruit het effect van HCO3- verwijdering op de kinetiek van ASL pH in de tijd in niet-CF en CF hAECs. De initiële tarieven van de verzuring werden verkregen via de helling van een rechte lijn gemonteerd op 7 tijd-punten na HCO3- verwijdering. Gegevens vertegenwoordigen de middelen ± SEM van n = 6 en 7 experimenten op niet-CF-en CF-culturen respectievelijk. Bsamenvatting van de initiële tarieven van de verzuring na HCO3- verwijdering. Gegevens vertegenwoordigen de middelen ± SEM van n = 6 en 7 experimenten op non-CF en CF culturen respectievelijk (Mann-Whitney test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de dynamische meting van de ASL pH in de primaire menselijke luchtweg epitheelcellen. De kritieke stappen omvatten het wassen van het slijm van het apicale oppervlakte van de cellen, het meten van en het aftrekken van de achtergrond gebruikend de zelfde parameters zoals in het experiment, het optimaliseren van de z-positie en de aanwinst en het uitvoeren van een in situ pH kaliberbepaling.

De eerste stap van het wassen van de cellen is van cruciaal belang als een dikke laag slijm kan (i) voorkomen dat de kleurstoffen van het bereiken van de periciliary laag (PCL) en (II) vertraging of voorkomen dat de detectie van veranderingen in de fluorescentie in reactie op agonisten/remmers. Onze methode werd ontwikkeld om te bestuderen hoe primair hAECs de activiteit van HCO3– en H+ vervoerders in reactie op agonisten moduleerde. Hoewel het interessant zal zijn om te onderzoeken hoe veranderingen in PCL pH betrekking hebben op veranderingen in slijm pH, verdere ontwikkeling van dit protocol nodig is, met inbegrip van het gebruik van verschillende moleculaire gewicht-dextrans te differentiëren de 2 lagen en z-scans door middel van de hele ASL.

Achtergrond meting is een andere belangrijke stap van dit protocol. De apicale oppervlakte van volledig gedifferentieerde primaire luchtweg epitheel is zelden volledig vlak dat de lichte weg en daarom de achtergrond zal beïnvloeden. Ervoor zorgen dat de achtergrond lezingen worden uitgevoerd in dezelfde lokale punten van de putten als tijdens het experiment is van cruciaal belang voor de reproduceerbaarheid en stabiliteit van de opnames.

Het optimaliseren van de z-positie en Gain zijn noodzakelijke stappen die moeten worden ingesteld voor elke verschillende concentratie van fluorescerende kleurstof die zal worden gebruikt. Dit voorkomt een hoge variatie tussen experimenten. Eenmaal ingesteld, onze assay biedt stabiele en reproduceerbare resultaten. Één van de redenen voor dit is dat de kleurstoffen op het apicale oppervlakte op de cellen in een klein volume van vloeistof worden toegevoegd die gemakkelijk door het epithelium wordt geabsorbeerd, dat een homogeen geëtiketteerde ASL verlaat. Een andere methode om de ASL vlek, dat kan even succesvol zijn, gebruikt droog poeder of een “Suspension” in PFC. Hoewel dit kan worden tijdbesparende (als de experimenten worden meestal uitgevoerd binnen 2 uur), is het onwaarschijnlijk dat de droge kleurstoffen volledig solubilize in de ASL en kan dus vormen klontjes. Aldus zullen de verschillende concentraties van pH-gevoelige kleurstof over de oppervlakte van de epitheelcellen worden gevonden.

De pH-kalibratie in situ is een belangrijke stap om accurate, reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Zoals getoond en toegelicht in de resultaten sectie, verschillen in ASL volumes zal invloed hebben op de fluorescentie telt en dus de geïnterpoleerde pH-waarden (Figuur 2 pt Figuur 3). Terwijl verschillende groepen eerder de pH-metingen van de ASL hebben gepubliceerd, is er een breed scala aan waarden verkregen, zelfs tussen verschillende studies die door dezelfde groep8,17zijn gepubliceerd. Wij geloven dat door het uitvoeren van kalibraties in situ, de resultaten zullen worden meer reproduceerbaar. Vergeleken met andere pH-kalibratie technieken, die gebruik maken van de hogeK+/nigericin (of multiple ionophores) methode om de standaard curve28,29,30te genereren, de hier gepresenteerde assay heeft het voordeel dat , zolang elke stap wordt uitgevoerd in een veiligheidskabinet, de cellen gebruikt voor de ASL pH kan worden gewassen, bewaard en hergebruikt voor andere experimenten op voorwaarde dat de uitgevoerde behandelingen niet onherroepelijk invloed op de epitheelcellen.

De ontwikkeling en optimalisering van deze test heeft reproduceerbare resultaten opgeleverd en wij geloven dat deze methode andere groepen met hun ASL pH meting zal helpen. Nochtans, heeft deze techniek ook sommige beperkingen toe te schrijven aan opstelling en het type van cellen die worden gebruikt. Monitoring ASL pH over een langere periode dan die hier gepresenteerd (> 8-10 h) kan moeilijk blijken als een lange-termijn hoge luchtvochtigheid omgeving kan schade aan de apparatuur en het feit dat de meeste plaat lezers bieden alleen de mogelijkheid om kinetische lezingen record over een bepaalde hoeveelheid tijd (meestal 24 uur). Het gebruik van volledig gedifferentieerde primaire hAECs is van cruciaal belang in de manier waarop verschillende stadia van differentiatie zal de expressie van HCO3– en H+ vervoerders beïnvloeden. Er is echter vrijwel geen mogelijkheid om nauwkeurig de controle van het volume van de ASL in cellen geteeld onder dunne film omstandigheden. Zoals vermeld in het protocol en de resultaten secties, veranderingen in volume van invloed op de fluorescentie-ratio en het is helaas noodzakelijk om te veronderstellen dat in cellen gekweekt uit een enkel individu, gezaaid op dezelfde dag op verschillende semi-doorlaatbaar ondersteunt, ASL volumes hetzelfde zal zijn. Als gevolg van deze beperking, zal elke agonist of remmer die invloed hebben op vocht afscheiding of absorptie van invloed op de ASL volume en vermoedelijk de fluorescentie ratio’s. Echter, in onze Assay, de kalibratiecurve wordt uitgevoerd aan het einde van het experiment, dus we kunnen veronderstellen dat deze veranderingen in het volume van invloed op de kalibratie ratio’s op dezelfde manier als tijdens de kinetische experiment. Om deze reden adviseren wij groepen die geïnteresseerd zouden zijn in de ontwikkeling van deze test, om ten minste 2-3 repliceren per voorwaarde getest, omdat dit zal zorgen voor de oprichting van een standaard curve voor elke aandoening te gebruiken.

Hier presenteren we een eenvoudige, semi-geautomatiseerde, Assay die het mogelijk maakt real-time meting van mucosale oppervlak pH onder dunne-film omstandigheden. Het heeft de capaciteit om dynamische pH reacties in vele culturen in een dichtbijgelegen-gelijktijdige manier te onderzoeken die inter en intra-donor vergelijkingen toestaat. Opschaling deze methode om een 96 goed plaat formaat met behulp van gepolariseerde systeem (HTS 96 goed platen)38 zou nog hogere doorvoersnelheid als een Drug Discovery assay. Bovendien hebben we laten zien hoe deze techniek kan worden gebruikt om de acute effect van agonisten op ASL pH studie en we hebben al gepubliceerd dat deze methode kan worden gebruikt om de lange-termijn effect van een apicale proton pomp remmer studie op CF hAECs ASL39. Zoals pH is aangetoond dat de infectie te reguleren, ontsteking, slijm viscositeit en Ion transport, het identificeren van moleculaire doelen die kunnen verhogen pH zal waardevol zijn in het onderzoekgebieden van chronische longziekten en deze techniek zal mogelijk vergemakkelijken de ontwikkeling van drug screening in gepersonaliseerde geneeskunde benaderingen. Tot slot, aangezien ontregeling in zuur-base homeostase speelt een belangrijke rol in andere ziekten, kan dit protocol worden aangepast, met optimalisatie stappen, om verschillende apparatuur (plaat lezers) en cel types, zoals andere epitheelcellen. Extracellulaire zuurgraad is een kenmerk van kanker40,41,42 en deze test kan helpen bepalen hoe solide tumoren produceren lage pHe of kan worden gebruikt als een low-throughput drug screening assay voor restauratie van pH homeostase. Evenzo, zoals voor chronische luchtwegaandoeningen, kan het ook een platform voor de ontwikkeling van een gepersonaliseerde geneeskunde aanpak.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door twee CF Trust strategisch onderzoekscentrum Grants (SRC003 en SRC013) en een medisch Onderzoekraad (MRC) vertrouwen in concept Grant (MC_PC_15030). JG werd gesteund door een toelage van de medische Stichting van het onderzoek (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB werd gesteund door een medisch Onderzoekraad clinicus Scientist Fellowship (de heer/M008797/1). IH werd ondersteund door een welkom Trust Clinical training Fellowship (203520/Z/16/Z). Het onderzoek werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor gezondheidsonderzoek Newcastle biomedisch onderzoekscentrum gevestigd in Newcastle Hospitals NHS Foundation Trust en de Universiteit van Newcastle. De standpunten zijn die van de auteur (s) en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, de NIHR of het ministerie van volksgezondheid. Primaire cellen van Dr. BOUCHE15R0 werden ondersteund door Cystic Fibrosis Foundation Grant (P30DK065988) en NIH Grant.

Materials

0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).
  2. Roomans, G. M., et al. Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 135-139 (2004).
  3. Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets. Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).
  4. Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).
  5. Garland, A. L., et al. Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).
  6. Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).
  7. Berkebile, A. R., McCray, P. B. Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 124-129 (2014).
  8. Tang, X. X., et al. Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).
  9. Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
  10. Hunt, J. F., et al. Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).
  11. Kostikas, K., et al. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).
  12. Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis. Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).
  13. Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients. American Journal of Rhinology & Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).
  14. Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).
  15. Coakley, R. D., et al. Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).
  16. Pezzulo, A. A., et al. Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung. Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).
  17. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
  18. Saint-Criq, V., Gray, M. A. Role of CFTR in epithelial physiology. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).
  19. . ECFS Patient Registry Annual Data Report Available from: https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf (2016)
  20. . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017 Available from: https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2017)
  21. Abou Alaiwa, M. H., et al. Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).
  22. Abou Alaiwa, M. H., et al. Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  23. McShane, D., et al. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).
  24. Schultz, A., et al. Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis. Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).
  25. Abou Alaiwa, M. H., et al. Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease. JCI Insight. 1 (8), (2016).
  26. Ngamtrakulpanit, L., et al. Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis. Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).
  27. Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate. Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).
  28. Jayaraman, S., Song, Y. Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).
  29. Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH. Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).
  30. Lennox, A. T., et al. ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation. Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).
  31. Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways. The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).
  32. Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways. FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).
  33. Garnett, J. P., et al. Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion. Scientific Reports. 6, 37955 (2016).
  34. Gorrieri, G., et al. Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release. Scientific Reports. 6, 36016 (2016).
  35. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).
  36. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).
  37. Matsui, H., et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).
  38. Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
  39. Delpiano, L., et al. Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).
  40. Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. 31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate. American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).
  41. Tannock, I. F., Rotin, D. Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Pesquisa do Câncer. 49 (16), 4373-4384 (1989).
  42. Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease. Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).

Tags

Real-timeSemi-automatedFluorescent MeasurementAirway Surface Liquid PHPrimary Human Airway Epithelial CellsIon ChannelsTransportersExtracellular PH RegulationCystic FibrosisAsthmaCOPDAir-liquid InterfaceBicarbonate BufferPlate ReaderTemperature ControlCarbon Dioxide ControlHumidity CassetteKinetic Loop

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image