Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

İnsan gönüllülerden alınan örneklerin kullanımı, Scripps Araştırma Enstitüsü Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokolleri takip etti. Kan bağışı ndan önce bağışçılardan bilgilendirilmiş onam alındı. 1. Reaktif Hazırlama Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) Ficoll-Plaque Plus izolasyonu ile normal insan donörlerinden periferik kan mononükleer hücrelerini kurtarın. fetal sığır serumu (FBS) ve dimetil sülfoksitte (DMSO) 50 milyon hücre/mL’de kriyokorun. Hücreleri -80 °C’de dondurun ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın. Sıralama için hedef antijen peptidlerin etiketleme Terminal biotin ile hedef proteine özgü (70 kalıntı uzunluğunda) peptidler oluşturun veya elde edin. Etiket 4 streptavidin ile her bir biyotinylated peptid kovalent PE bağlı (R-phycoerythrin) veya APC (allophycocyanin) ayrı tüpler. SA-PE ve 5,7 μM SA-APC için yaklaşık 3,2 μM son konsantrasyonu ile streptavidin (SA) için 9:1 peptid molar oranı kullanarak hazırlayın. Biotin tetramerleri negatif kontrol olarak hazırlayın. Her peptit karışımını bir gecede, karanlıkta, 4 °C’de yavaş karıştırma ile kuluçkaya yatırın. Polyakrilamid boncuklar içeren mikrosütunlar aracılığıyla etiketli peptidler geçirerek sınırsız florofor kaldırın. Peptit tetramerlerini 2 aya kadar 4 °C’de saklayın. 2. Hücre Sıralama CD22+ izolasyonundan önce en az 1 saat ila 16 saat, donör PBMC’leri eritin ve 37 °C’de dinlenmeye izin verin. Dondurulmuş PBMC şişelerini dondurucudan çıkarın ve hemen 37 °C’lik bir su banyosuna aktarın. Şişeler neredeyse çözüldüğünde, çalışma alanına aktarın. Her şişenin içeriğini önceden ısıtılmış ortam içeren 50 mL’lik bir tüpe aktarın (bağışçıları ayrı tutmak). 50 mL’lik son hacme orta ekleyin. İçeriği yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 6 dk için 370 x g santrifüj. Supernatant atın, RPMI tam orta 15 mL hücreleri yeniden askıya ve bir hücre sayımı gerçekleştirin. Hücre konsantrasyonu 2,0 x 107 hücre/mL RPMI tam orta ile ayarlayın ve hücreleri t75 şişe veya daha büyük ve en az 1 saat ve en fazla 16 saat için 37 °C’de kuluçka ya da çözülmüş hücreler için kurtarma süresi sağlamak için tüp hücre aktarın. Hücreleri toplayın (istenirse havuz) ve santrifüj 370 x g’de 6 dk 4 °C’de. 5 mL buz gibi macs arabelleği (PBS, pH 7.6 %0.5 BSA ve 2 mM EDTA içeren) hücreleri atın, MACS arabelleği yle 50 mL’ye getirin ve hücre sayımı yapın. 4 °C’de 7 dk için 400 x g’deki hücreleri santrifüj edin. CD22 mikroboncukları yakalayarak OLUMLU seçerek CD22+ B hücrelerini izole edin. Tüm yıkıntılar için MACS arabelleği kullanın. 4 °C’de 7 dk için 400 x g kont ve santrifüj. Beklenen iyileşme toplam PBMC nüfusunun %5-10’udur. Hücreleri mL FACS tamponu başına 40 milyon (Tris tampon, pH 8.0 %0.5 BSA ve 2 mM EDTA içeren) yeniden askıya alın ve bağışçıların hücre boyamasını tek tek veya havuz olarak devam ettirin. Bellek B hücre sıralama için leke hücreleri Sitometre kurulumu için bir hücre aliquot’u çıkarın ve kullanılan etiketleme floroforlarının her biri için tazminat alın. Bir denetim olarak lekesiz hücreleri ekleyin. Elde edilen CD22+ hücre sayısı için son boyama hacmini hesaplayın (100°L’de 2 milyon boyama). B hücreleri (CD19-PerCP-Cy5.5), IgG (IgG-FITC) ve bellek bölmesi (CD27-PECy7) için üreticilerin seyreltme önerilerine göre hücre dışı belirteçler ekleyin ve hafifçe karıştırın. Aliquot 107 hücreleri negatif kontrol için 1,5 mL tüp içine ve 15 mL tüp kalan hücreleri aktarın. Çift etiketli biotin-SA tetramerleri, her biri PE ve APC için 36 nM’lik son konsantrasyonla negatif kontrol tüpüne ekleyin ve facs tamponuyla (örn. 10 peptid x 36 nM=360 nM) hacmi 0,5 mL finale getirin. PE ve APC için her biri 36 nM’de sıralama tüpüne peptit tetramerleri ekleyin ve hücreleri TBS Tampon ile 100°L’de 2×10 6’ya getirin. Karanlıkta 4 °C’de ve 30-60 dk hafif rotasyonla kuluçkaya yatırın. Yıkama 2x 4 °C, 400 x g, 7 dk, son yıkamadan önce saymak için bir aliquot kaldırarak. 5 mL filtre kapağı tüpleri kullanarak hücreleri filtreleyin. HÜCRE ZARI bütünlüğünün bir belirteci olarak sıralamadan hemen önce 0,3 μM son konsantrasyonuna DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindole) lekesini ekleyin. Akış sitometrisi ile tek hücreli sıralama Sıralama için 96 kuyulu PCR plakalardan 48 kuyu hazırlayın. Ana karışım hazırlayın: (2 μL 10x RT tampon, 0,5 μL RNase inhibitörü, 7,5 μL steril PCR sınıfı su) numune başına. Aliquot 10 μL/well, kapak ve sıralamaiçin hazır olana kadar 4 °C’de saklayın. Hücre ayırıcısı üzerindeki negatif denetimi çalıştırın ve tüm örneği analiz edin. Tek hücre li sıralama için uygun hücre popülasyonlarını yalıtmak için akış sitometri kapılarını ayarlayın. Arsa FSC alan vs SSC alan ve lenfositler izole etmek için Gate R1 ayarlayın. FSC yüksekliği vs FSC genişliği arsa ve FSC doublets hariç Gate R3 ayarlayın. SSC yüksekliği vs SSC genişliği arsa ve SSC doublets hariç Gate R4 ayarlayın. SSC yüksekliği vs DAPI’yi çizin ve Canlı hücreleri yalıtmak için R5 Kapısı’nı ayarlayın (DAPI-). Çizim IgG vs CD19 ve IgG+ B hücreleri (CD19+ IgG+ )izole etmek için Kapı R6 ayarlayın. Çizim IgG vs CD27 ve bellek B hücreleri (CD27yüksek)seçmek için Gate R7 ayarlayın. Arsa Antigen-PE (Ag-PE) vs antijen-APC (Ag-APC) ve çift pozitif kapı olayların düşük sayıda bir Ag-PE+/ Ag-APC+ çeyrek olarak Gate R8 ayarlayın. Sinyalin gürültüye doğru belirlenmesi için antijen-pozitif (Ag+) örneğinden eşit sayıda bellek hücresi toplayın. Tek hücreleri cd19+ CD27+ Ag-PE+ Ag-APC+ (Gate R8) içeren tek hücreleri hazırlanmış 96 kuyulu PCR plakalarına sıralayın. Alüminyum bant pedleri ile kapak plakaları, 400 x g 1 dakika santrifüj ve gelecekteki klonlama için -80 °C’de saklayın. 3. Tek Hücreli Klonlama Ters transkripsiyon reaksiyonları Tek B hücre sıralama plakasını 80 °C’den çıkarın. 2 dk. Açmadan önce kuyuların altındaki havuz içeriğini havuza 3.300 x g 2 dakika boyunca buz üzerinde çözülme. Ters astar olarak non-iyonik deterjan ve oligo (dT) içeren bir dNTP/tampon ana karışımı hazırlayın. Tek hücreiçeren her kuyuya enzim karışımı ekleyin ve KARıŞTıRMAYıN. 65 °C’de 5 dk kuluçka. Toplam hacmi 20 μL’ye çıkarmak için 100 mM DTT, RNase inhibitörü ve ters transkriptaz enzimi içeren enzim ana karışımını ekleyin. PCR adımlarını başlatmadan önce buza aktarma Çok adımlı iç içe PCR reaksiyonları Ağır zincir (HC) ve hafif zincir (LC) amplifikasyonu için ayrı iç içe pcr reaksiyonları kullanılır. PCR amplifikasyonunun ilk turu için (Adım I), hc ve LC değişken bölgelerini ayrı PCR reaksiyonlarında yükseltmek içinileri astar havuzu ve tek bir ters astar kullanın (Şekil 2). Tasarım olarak, ileri astar havuzu germline lideri (L) dizileri büyük bir yüzdesi yükseltmek ve ters astar ışık zincirleri için kappa (κ) ve lambda (λ) dahil olmak üzere her zincirin downstream sabit bölgelere özgüdür16. Her PCR (Adım I) reaksiyonu için şablon olarak 2,5 μL cDNA ürünü kullanın. Her biri için 1 μM’lik son reaksiyon konsantrasyonuna astar ekleyin. 10x polimeraz tamponu ile 2x konsantrasyonu iki katına çıkararak son hacmi reaksiyon başına 25°L’ye getirin. HC PCR reaksiyonlarını 50 döngü boyunca [94 °C/4 dk; 94 °C /15 s, 55 °C /20 s, 68 °C/60 s; 68 °C/3 dk] kullanarak çalıştırın. 50 döngü için [98 °C/4 dk; 98 °C /15 s, 72 °C /20 s, 72 °C/60 s; 72 °C/3 dk] kullanarak LC PCR reaksiyonlarını çalıştırın. Her (Step II) PCR reaksiyonu için şablon olarak Adım I ürününün 2,5 μL’sini kullanın. HC ve LC (κ ve λ) çerçevesi 1 bölgesine özgü ileri astar havuzunu ve her antikor zincirinin bağlantı bölgesine özgü ters astar havuzunu ekleyin. 10x polimeraz tamponu 2x konsantrasyonuna iki katına çıkın ve Adım I ile aynı parametreleri kullanarak PCR reaksiyonlarını 50’şer döngü çalıştırın. Pozitif amplifikasyon vuruşlarını görselleştirmek için tamamlanmış PCR reaksiyonlarını %1 agarose jel üzerinde çalıştırın. Eşleştirilmiş ampliconları (aynı hücreden hem ağır hem de hafif zincir) kurtarın ve jel ekstraksiyonu yoluyla izole edin. Doğru ligasyon karışımı hesaplamaları için OD260 ile DNA parça konsantrasyonunu belirleyin. Kurtarılan ağır ve hafif zincir parçalarını bir bağlayıcı parçası ve ifade vektör omurgasını ticari bir kit kullanarak 4 parçalı ligasyon reaksiyonu kullanarak birleştirin. Ticari bir kit kullanarak kimyasal olarak yetkin bakterilere ligasyon reaksiyonları dönüştürün. Antibiyotik plakalara bir kez kaplandıktan sonra, kalan dönüşüm kültürüne 4 mL büyüme ortamı (antibiyotikle) ekleyin ve 250 rpm’de bir gecede 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Bu “ligasyon karışımı kültür.” Ticari bir kit kullanarak gece ligasyon karışımı kültürlerden miniprep DNA hazırlayın ve ortaya çıkan plazmid DNA konsantrasyonunu belirlemek. 4. Antijen özgüllüğünün teyidi için ELISA Ekranı Transfect 10 μg miniprep DNA katyonik lipid bazlı reaktif ile 10 mL süspansiyon 293 hücre içine, ve 3-4 gün boyunca kuluçka 37 °C (8% CO2) ise 125 rpm döndü. Hasat için, santrifüj kültürü 10 dk 1.000 x g ve açıklık medya kurtarmak. Protein A’ya yakınlık yoluyla süpernatantlarda IgG konsantrasyonu ölçün. Her IgG’yi (supernatant içinde) 20 μg/mL’de enzime bağlı adsorbent testi (ELISA) ile streptavidin plakası üzerinde yakalanan veya negatif kontrol olarak aktin olarak yakalanan tek tek peptidlere karşı test edin. Rekombinant klonları tespit etmek için insan IgG Fab karşı bir keçi anti-insan peroksidaz ikincil antikor kullanın. Arka planın çıkarTını ndan sonra, OD > 0.5 ekran pozitif olarak tanımlanır. Ek bir ELISA gerçekleştirerek ekran pozitif vuruşlarını onaylayın, mL başına 20 g’dan başlayan bir konsantrasyon eğrisi oluşturmak için IgG süpernatant seyreltmelerini kullanarak ve ilk ekran ELISA’da reaktivite gösteren her bir antijen için OD’ye karşı çizim yaparak.