الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات
Summary
توفر تقنية CRISPR-Cas9 طريقة فعالة لتحرير الجينوم الثدييات بدقة في أي نوع من أنواع الخلايا وتمثل وسيلة جديدة لأداء الشاشات الوراثية على نطاق الجينوم. ويرد هنا بروتوكول مفصل يناقش الخطوات اللازمة للنجاح في أداء شاشات كريسبر-كاس9 المجمعة على نطاق الجينوم.
Abstract
وقد أدى تحرير الجينوم باستخدام نظام كريسبر-كاس إلى تقدم كبير في القدرة على تحرير الجينومات من مختلف الكائنات الحية بدقة. وفي سياق خلايا الثدييات، تمثل هذه التكنولوجيا وسيلة جديدة لإجراء شاشات جينية على نطاق الجينوم من أجل دراسات علم الجينوم الوظيفية. تسمح مكتبات الإرشاد RNAs (sgRNA) التي تستهدف جميع إطارات القراءة المفتوحة بتوليد الآلاف من الاضطرابات الوراثية السهلة في مجموعة واحدة من الخلايا التي يمكن فحصها لأنواع ظاهرية محددة لتوريط وظيفة الجينات والعمليات الخلوية في بطريقة غير متحيزة ومنهجية. توفر شاشات CRISPR-Cas للباحثين طريقة بسيطة وفعالة وغير مكلفة للكشف عن المخططات الوراثية للأنماط الظاهرية الخلوية. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل التفاضلي للشاشات التي يتم إجراؤها في مختلف خطوط الخلايا ومن أنواع السرطان المختلفة يمكن أن يحدد الجينات الضرورية من حيث السياق في الخلايا السرطانية، مما يكشف عن الأهداف المحتملة لعلاجات محددة مضادة للسرطان. ويمكن أن يكون أداء الشاشات على نطاق الجينوم في الخلايا البشرية أمراً شاقاً، لأن ذلك ينطوي على معالجة عشرات الملايين من الخلايا ويتطلب تحليلاً لمجموعات كبيرة من البيانات. غالباً ما يتم تجاهل تفاصيل هذه الشاشات، مثل توصيف خط الخلية، واعتبارات مكتبة CRISPR، وفهم حدود وقدرات تقنية CRISPR أثناء التحليل. ويرد هنا بروتوكول مفصل للأداء الناجح للشاشات المجمعة على نطاق الجينوم CRISPR-Cas9.
Introduction
كريسبر-كاس، قصيرة لتتجمع بانتظام بين المسافات قصيرة باليندروميك وتكرار المرتبطة كريسبر، يتكون من بروتين nuclease واحد (على سبيل المثال، Cas9) في مجمع مع الحمض النووي الريبي دليل الاصطناعية (sgRNA). يستهدف هذا المركب الريبونوكليوبروتين إنزيم Cas9 للحث على فواصل الحمض النووي المزدوج ة في موضع جيني محدد1. يمكن إصلاح الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل عن طريق إصلاح موجه ة (HDR) أو، بشكل أكثر شيوعًا، من خلال الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ)، وهي آلية إصلاح عرضة للخطأ تؤدي إلى الإدراج و/أو الحذف (INDELS) التي تعطل في كثير من الأحيان وظيفة الجينات 1.كفاءة وبساطة كريسبر تمكن من مستوى لا يمكن تحقيقه من قبل من استهداف الجينوم الذي يتجاوز بكثير تقنيات تحرير الجينوم السابقة [أي، الزنك الاصبع nucleases (ZNF) أو الفاعل المنشط النسخ مثل nucleases ( TALENS)، وكلاهما يعاني من تعقيد التصميم المتزايد، وانخفاض كفاءة التغوط، والقيود في تحرير الجينات متعددة2].
وقد أتاح التطبيق البحثي الأساسي لتحرير الجينوم القائم على الحمض النووي الريبي من كريسبر بكفاءة وبتكلفة زهيدة للعلماء أن يستجوبوا بكفاءة وبتكلفة غير مكلفة وظائف الجينات الفردية وطبولوجيا شبكات التفاعل الجيني. وقد تعززت القدرة على أداء الشاشات الوظيفية على نطاق الجينوم إلى حد كبير باستخدام نظام كريسبر-كاس، لا سيما عند مقارنتها بتكنولوجيات الاضطراب الجيني السابقة مثل تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وموت فخ الجينات. على وجه الخصوص، RNAi يعاني من آثار عالية خارج الهدف وضربة قاضية غير مكتملة، مما أدى إلى انخفاض الحساسية والخصوصية بالمقارنة مع كريسبر3،4،5،في حين أن أساليب فخ الجينات هي ممكنة فقط في haploid خلايا لشاشات فقدان وظيفة، والحد من نطاق نماذج الخلية التي يمكن استجوابها6. قدرة كريسبر على توليد الجينات كاملة خروج المغلوب يوفر نظام أكثر قوة بيولوجيا لاستجواب الأنماط الظاهرية متحولة، مع انخفاض مستوى الضجيج، والحد الأدنى من الآثار خارج الهدف والنشاط المستمر عبر الكواشف5. تتوفر الآن على نطاق واسع مكتبات CRISPR-Cas9 sgRNA التي تستهدف الجينوم البشري بأكمله، مما يسمح بتوليد الآلاف من الضربات الذاتية للجين في تجربةواحدة3و7و8و9 .
لقد قمنا بتطوير مكتبات فريدة من نوعها على نطاق الجينوم كريسبر-Cas9 sgRNA lentiviral تسمى مكتبات تورونتو خروج المغلوب (TKO) (المتاحة من خلال Addgene) التي هي المدمجة وتسلسل الأمثل لتسهيل شاشات الجينوم وظيفية عالية الدقة. أحدث مكتبة، TKOv3، تستهدف ~ 18،000 الجينات الإنسان البروتين الترميز مع 71،090 أدلة الأمثل لكفاءة التحرير باستخدام البيانات التجريبية10. بالإضافة إلى ذلك، TKOv3 متاح كمكتبة مكون واحد (LCV2::TKOv3، معرف Addgene #90294) التعبير عن Cas9 وsgRNAs على متجه واحد، مما يخفف من الحاجة إلى توليد خلايا ثابتة التعبير عن Cas9، مما يتيح ضرب على نطاق الجينوم عبر مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الثدييات. TKOv3 هو متاح أيضا في ناقلات دون Cas9 (pLCKO2::TKOv3, معرف Addgene # 125517) ويمكن استخدامها في الخلايا التي تعبر Cas911.
يمكن أن يتعرض عدد الخلايا المحررة من CRISPR-Cas9 على نطاق الجينوم لظروف نمو مختلفة، مع وفرة sgRNAs مع مرور الوقت كمياً من خلال تسلسل الجيل التالي، مما يوفر قراءة لتقييم التسرب أو إثراء الخلايا ذات الجينات الوراثية التي يمكن تتبعها الاضطرابات. يمكن تسخير مكتبات كريسبر للخروج من الباب لتحديد الجينات التي تسبب، عند الاضطراب، عيوب ًا في اللياقة البدنية الخلوية، أو حساسية معتدلة للأدوية (مثل الجينات الحساسة أو المقاومة)، أو تنظم التعبير عن البروتين (مراسل، على سبيل المثال)، أو تكون مطلوبة لمعين وظيفة المسار والدولة الخلوية12،13،14. على سبيل المثال، شاشات اللياقة البدنية التفاضلية في خط الخلايا السرطانية يمكن تحديد كلمن استنفاد أو الحد من الأنكوجينيات والإثراء أو زيادة الجينات مثبطات الورم3،14،15. وبالمثل، يمكن استخدام جرعات وسيطة من الأدوية العلاجية تكشف عن كل من مقاومة المخدرات وجينات التوعية16،17.
وترد هنا بروتوكول فحص مفصل لفحص فقدان الوظائف على نطاق الجينوم CRISPR-Cas9 باستخدام مكتبات تورونتو للخروج من الباب العام (TKOv1 أو v3) في خلايا الثدييات من توليد المكتبات، وأداء الفرز إلى تحليل البيانات. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تحسينه للفرز باستخدام مكتبات تورونتو خروج المغلوب، فإنه يمكن تطبيقه وتصبح قابلة للتحجيم لجميع المكتبات تجمع كريسبر sgRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرًا لبساطتها في الاستخدام والموثوقية العالية، فقد تم اعتماد تقنية CRISPR على نطاق واسع كأداة اختيار لتحرير الجينوم بدقة. يوفر فحص كريسبر المجمع طريقة لاستجواب الآلاف من الاضطرابات الوراثية في تجربة واحدة. في الشاشات المجمعة، تعمل مكتبات sgRNA كالباركود الجزيئي، حيث أن كل تسلسل فريد ويتم تع?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل جينوم كندا، وصندوق أونتاريو للبحوث، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Referências
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
