Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

CRISPR-Cas, abreviatura de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas y nucleasas asociadas a CRISPR, consiste en una única proteína de nucleasa (por ejemplo, Cas9) en complejo con un ARN guía sintético (sgRNA). Este complejo de ribonucleoproteínas se dirige a la enzima Cas9 para inducir roturas de ADN de doble cadena en un locus genómico específico¹. Los cortes de doble cadena se pueden reparar mediante reparación dirigida por homología (HDR) o, más comúnmente, a través de unión final no homóloga (NHEJ), un mecanismo de reparación propenso a errores que da como resultado la inserción y/o deleciones (INDELS) que con frecuencia interrumpen la función génica ¹. La eficiencia y simplicidad de CRISPR permite un nivel de segmentación genómica hasta ahora inalcanzable que supera con creces las tecnologías de edición del genoma anteriores [es decir, nucleasas de dedos de zinc (ZNF) o nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción ( TALENS), ambos sufren de mayor complejidad de diseño, menor eficiencia de transfección y limitaciones en la edición de genes multiplex²].

La aplicación básica de investigación de la edición del genoma basado en ARN de una sola guía de CRISPR ha permitido a los científicos interrogar de manera eficiente y económica las funciones de los genes individuales y la topología de las redes de interacción genética. La capacidad de realizar pantallas funcionales de todo el genoma se ha visto muy mejorada por el uso del sistema CRISPR-Cas, particularmente en comparación con tecnologías de perturbación genética anteriores, como la interferencia del ARN (ARN) y la mutagénesis de las trampas genéticas. En particular, el ARNi sufre de altos efectos fuera del objetivo y derribos incompletos, lo que resulta en una menor sensibilidad y especificidad en comparación con CRISPR^3,4,5, mientras que los métodos de captura genética sólo son factibles en haploides células para pantallas de pérdida de funciones, limitando el alcance de los modelos de celda que se pueden interrogar⁶. La capacidad de CRISPR para generar un knock-out genético completo proporciona un sistema biológicamente más robusto para interrogar fenotipos mutantes, con bajo ruido, efectos mínimos fuera del objetivo y actividad constante a través de los reactivos^5. Las bibliotecas de sgRNA CRISPR-Cas9 que se dirigen a todo el genoma humano están ahora ampliamente disponibles, permitiendo la generación simultánea de miles de noqueos genéticos en un solo experimento^3,7,8,9 .

Hemos desarrollado bibliotecas lentivirales de sgRNA únicas para todo el genoma CRISPR-Cas9 llamadas las bibliotecas Toronto Knock-out (TKO) (disponibles a través de Addgene) que son compactas y están optimizadas para secuencias para facilitar pantallas genómicas funcionales de alta resolución. La última biblioteca, TKOv3, se dirige a 18.000 genes de codificación de proteínas humanas con 71.090 guías optimizadas para la eficiencia de edición utilizando datos empíricos¹⁰. Además, TKOv3 está disponible como una biblioteca de un componente (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) que expresa Cas9 y sgRNAs en un solo vector, aliviando la necesidad de generar células estables de expresión de Cas9, lo que permite el desconexión del genoma en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. TKOv3 también está disponible en un vector sin Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID 125517) y se puede utilizar en celdas que expresan Cas9¹¹.

Una población celular editada por CRISPR-Cas9 en todo el genoma puede estar expuesta a diferentes condiciones de crecimiento, con la abundancia de sgRNA a lo largo del tiempo cuantificada por la secuenciación de próxima generación, proporcionando una lectura para evaluar la deserción o el enriquecimiento de células con Perturbaciones. Las bibliotecas CRISPR knock-out se pueden aprovechar para identificar genes que, tras la perturbación, causan defectos de aptitud celular, sensibilidad moderada a los medicamentos (por ejemplo, genes sensibles o resistentes), regulan la expresión de proteínas (por ejemplo, reportero), o son necesarios para un determinado función de la vía y estado celular^12,13,14. Por ejemplo, las pantallas de aptitud diferencial en una línea celular cancerosa pueden identificar tanto el agotamiento o la reducción de oncogenes como el enriquecimiento o un aumento de los genes supresores tumorales^3,14,15. Del mismo modo, el uso de dosis intermedias de fármacos terapéuticos puede revelar tanto la resistencia a los fármacos como los genes de sensibilización^16,17.

Aquí se proporciona un protocolo de cribado detallado para la detección de la pérdida de función CRISPR-Cas9 a escala del genoma utilizando las bibliotecas Knock-out de Toronto (TKOv1 o v3) en células de mamíferos desde la generación de bibliotecas, el rendimiento de cribado hasta el análisis de datos. Aunque este protocolo se ha optimizado para su detección con las bibliotecas Knock-out de Toronto, se puede aplicar y convertirse en escalable para todas las bibliotecas agrupadas de SgRNA de CRISPR.