A Double Humanized BLT-fareler Modeli Kararlı Bir İnsan-Benzeri Gut Mikrobiyom ve İnsan Bağışıklık Sistemi featuring
Summary
Biz fonksiyonel bir insan bağışıklık sistemi ve istikrarlı bir engrafted insan benzeri bağırsak mikrobiyomu özelliği çift insanlaşmış BLT-fareler üretmek için yeni bir yöntem açıklar. Bu protokol mikropsuz fareler veya gnotobiyotik tesisler için gerek kalmadan takip edilebilir.
Abstract
İşlevsel bir insan bağışıklık sistemine sahip olan insanlaşmış fareler (hu-fareler) temelde insan patojenleri ve hastalık çalışma değişti. İnsanlarda veya diğer hayvan modellerinde incelenmesi zor veya imkansız olan hastalıkları modellemek için kullanılabilirler. Bağırsak mikrobiyomu insan sağlığı ve hastalığı üzerinde derin bir etkisi olabilir. Ancak, murine bağırsak mikrobiyomu insanlarda bulunan çok farklıdır. Bir engrafted insan bağırsak mikrobiyomu var gelişmiş pre-klinik hu-fare modelleri için bir ihtiyaç vardır. Bu nedenle, hem insan bağışıklık sistemi hem de kararlı insan benzeri bağırsak mikrobiyomu özelliği çift hu-fareler oluşturdu. Nod. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareler immün yetmezlik yüksek düzeyde nedeniyle insanlaşma için en iyi hayvanlardan biridir. Ancak, mikropiçermeyen NSG fareler, ve diğer çeşitli önemli mikropiçermeyen fare modelleri şu anda ticari olarak mevcut değildir. Ayrıca, birçok araştırma ayarları gnotobiyotik tesislere erişim yok, ve gnotobiyotik koşullar altında çalışan genellikle pahalı ve zaman alıcı olabilir. Daha da önemlisi, mikrop içermeyen farelermikropların engraftment sonra bile var olan çeşitli bağışıklık eksiklikleri var. Bu nedenle, mikropsuz hayvanlar veya gnotobiyotik tesisler gerektirmeyen bir protokol geliştirdik. Çift hu-fare üretmek için, NSG fareler kemik iliği, karaciğer, timus-humanized (hu-BLT) fareler oluşturmak için ameliyat öncesi radyasyon ile tedavi edildi. Fareler daha sonra önceden varolan murine bağırsak mikrobiyom tüketmek için geniş spektrumlu antibiyotikler ile tedavi edildi. Antibiyotik tedavisi sonrası, fareler oral gavaj yoluyla sağlıklı insan donör örnekleri ile dışkı nakli yapıldı. Çift hu-BLT fareler, nakledilen bireysel insan donör örneğine dayalı benzersiz 16S rRNA gen profillerine sahipti. Daha da önemlisi, nakledilen insan benzeri mikrobiyom, nakil sonrası 14,5 haftaya kadar çalışma süresince çift hu-BLT farelerde stabildi.
Introduction
Humanized fareler (hu-fareler) hematopoyis, bağışıklık, kanser, otoimmün hastalık ve bulaşıcı hastalık1dahil olmak üzere insan sağlığı ve hastalığıbirçok yönünü çalışma dönüştürdü1 ,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Bu hu-fareler işlevsel bir insan bağışıklık sistemine sahip ve insan ait patojenler ile enfekte olabilir diğer fare modelleri üzerinde ayrı bir avantaja sahip. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyomu önemi obezite, metabolik sendrom, inflamatuar hastalıklar ve kanser 10,11,12gibi birçok insan hastalıklarında rolü ile gösterilmiştir, 13. yıl. Mukozal bağışıklık sistemi ve bağırsak mikrobiyomu karşılıklı bağırsak ve sistemik homeostaz korumak için düzenlenir. Bağışıklık sistemi bağırsak mikrobiyomu tarafından sunulan antijenler tarafından şekillendirilir ve bağışıklık sistemi kommensal bağırsak bakterilerinteşvik ve patojenleri ortadan kaldırarak önemli bir düzenleyici rol oynar14,15, 16– Ancak, hu-farelerin bağırsak mikrobiyomu iyi karakterize edilmemiştir ve murine bağırsak mikrobiyomu insanlardan kompozisyon ve fonksiyon önemli ölçüde farklıdır17. Bu murine ve insan bağırsak arasındaki evrimsel, fizyolojik ve anatomik farklılıklar yanı sıra hu-fare hastalığı modellerinin deneysel sonuçlarını etkileyebilir diyet gibi diğer önemli faktörler nedeniyle18. Bu nedenle, hu-farelerin murine bağırsak mikrobiyomu sınıflandırma ötesinde, bir insan bağışıklık sistemi ve insan bağırsak mikrobiyomu hem de sahip bir hayvan modeli in vivo insan hastalığının karmaşık etkileşimleri incelemek için gereklidir.
Doğrudan insan deneklerde insan hastalıklarının incelenmesi genellikle pratik değildir veya etik değildir. Birçok hayvan modeli insan immün yetmezlik virüs tip 1 (HIV-1) gibi insan patojenleri incelemek için kullanılamaz. İnsan olmayan primat modelleri genetik olarak dışlanır, çok pahalıdır ve birçok insan patojenine karşı duyarlı değildir. Mikropsuz (GF) olarak türetilmiş ve insan benzeri bağırsak mikrobiyomları ile yeniden yapılı fareleryaygın insan sağlığı ve hastalık 19,20çalışma için kullanılmıştır. Ancak, bu hayvanların bir insan bağışıklık sistemi yok ve GF hayvanlar ile çalışan özel tesisler, prosedürler ve uzmanlık gerektirir. Bu nedenle, bağırsak mikrobiyomu ve insan bağışıklık sisteminin karmaşık ilişkisini incelemek için geliştirilmiş pre-klinik modeller için bir ihtiyaç vardır. NOD gibi birçok fare suşları. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), ticari olarak GF olarak kullanılamaz. GF hayvanlar da tamamen mikropların engraftment tarafından ters değildir uzun süreli bağışıklık eksiklikleri muzdarip olabilir21. Bu nedenle, belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında hem fonksiyonel bir insan bağışıklık sistemi ve istikrarlı insan benzeri bağırsak mikrobiyomu içeren bir çift hu-fare oluşturdu. Çift hu-fare üretmek için, kemik iliği, karaciğer, timus humanized fareler (hu-BLT) oluşturmak için NSG fareler üzerinde ameliyat yapıldı. Hu-BLT fareler daha sonra geniş spektrumlu antibiyotikler ile tedavi edildi ve daha sonra sağlıklı bir insan donör örneği ile dışkı nakli verildi. Biz 45 çift hu-BLT fareler ve 4 insan dışkı donör örnekleri 173 dışkı örneklerinin bakteriyel bağırsak mikrobiyomu karakterize. Çift hu-BLT fareler, nakledilen bireysel insan donör örneğine dayalı benzersiz 16S rRNA gen profillerine sahiptir. Daha da önemlisi, nakledilen insan benzeri mikrobiyom, nakil sonrası 14,5 haftaya kadar çalışma süresince farelerde stabildi. Buna ek olarak, öngörülen metagenomlar çift hu-BLT farelerin insan donör örneklerine daha çok benzeyen hu-farelerden farklı tahmin edilen fonksiyonel kapasiteye sahip olduğunu göstermiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, hem işlevsel bir insan bağışıklık sistemi hem de istikrarlı bir insan benzeri bağırsak mikrobiyomu özelliği çift hu-BLT farelerin oluşturulması içindir. Bu protokol, GF hayvanlarına ve gnotobiyotik tesislere ihtiyaç duymadan diğer insanlaşmış veya insanlaştırılmayan fare modellerine uyarlanabilir. Burada açıklanan yöntemler nispeten basit olmakla birlikte, çift hu-BLT farelerin başarılı yaratılması için önemli olan birkaç kritik ayrıntı vardır. NSG farel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yanmin Wan, Guobin Kang ve Pallabi Kundu’ya BLT-insanlaşmış farelerin üretilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Nebraska Araştırma Ağı’ndan Fonksiyonel Genomik NE-INBRE P20GM103427-14, Nörosensorysystems CoBRE P30GM110768 Moleküler Biyolojisi, Fred & Pamela’dan kısmi destek alan UNMC Genomics Çekirdek Tesisi’ne teşekkür ederiz. Buffett Kanser Merkezi – P30CA036727, Kök ve Rhizobiome Yenilik Merkezi (CRRI) 36-5150-2085-20 ve Nebraska Araştırma Girişimi. Biz Nebraska Üniversitesi – Lincoln Yaşam Bilimleri Ek ve personel yardımiçin teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hiber01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Kronik HIV Enfeksiyonu ve Yaşlanma NeuroAIDS (CHAIN) Merkezi, 1R01AI111862 Q Li tarafından desteklenmiştir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin hazırlanması veya yayınlanmak üzere karar verme de hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
Referências
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
