大鼠中位神经再生评价的功能与生理方法

涉及动物主题的所有程序均获得葡萄牙里斯本新大学医学院机构动物护理和使用委员会和道德委员会的批准（08/2012/CEFCM）。 1. 中位神经手术 注：在手术过程中遵循无菌技术。使用个人防护仪器（PPE）和穿无菌手术礼服17。手术前自动扣下所有必需的手术器械（参见材料表）。 使用12周大的威斯塔老鼠。在手术前7天，为他们提供12小时浅暗循环，为他们提供食物和水。麻醉前，称量大鼠以确定所需的麻醉量。 用氯胺酮（40~80毫克/千克体重）和锡拉辛（5~10毫克/千克体重）的混合物对大鼠进行麻醉。检查麻醉的深度，如对脚趾捏缺乏反应，以及在整个过程中观察呼吸率。,19如果呼吸速率超过110个周期/分钟或运动对脚趾捏的反应被观察到18、20，则18,提供额外的性痛。 注射1毫克/千克的旋律，提供先发制人的肛门20，21。20, 为了避免手术期间的角膜磨损，在两只眼睛上涂抹眼膜凝胶。 使用脱毛霜去除右侧中毛上的头发。一旦完成，用温暖的盐水清洗，以去除奶油17。 将大鼠放在加热垫上的上位。在手术部位涂抹碘或氯西丁手术磨砂。离开它至少15s，然后用乙醇擦拭。重复应用程序 3 倍。在继续手术之前，确保磨砂与皮肤接触至少 2 分钟。注：联系您的研究单位的感染控制当局，寻找替代协议，以防止手术部位感染19。 切除手术区域17。注：在严格的无菌条件下执行所有程序19。 使用编号 15 的手术刀刀片，将右臂和胸腔区域中部的皮肤与深胸平面倾斜。使用电烧灼热小心地烧灼任何出血血管。 小心地划分胸膜，它呈现为覆盖肌肉的尖刀护套，使用热灼热或一把钝剪刀，注意不要损坏手臂中部方面的血管和神经结构。 在胸腔主要肌肉的终端插入下直白打开一把剪刀，以挑逗这种肌肉远离底层的关节动脉和静脉，以及从胸腔丛的终端分支。 用电烧灼分插入胸肌主要肌肉。暴露和节胸小肌肉。 从胸血管和从关节神经开始从关节区域到肘部，从大孔中直接解剖MN。这允许接触骨骼丛的不同终端分支，即中位、ulnar、径向、关节和肌肉神经（图2）。 分离不同的实验组，如下所述。 仅通过解剖 MN 创建Sham组。 使用数字5显微外科钳子或类似仪器22、23,23压缩手臂中间部分的MN，以15s压缩MN，创建粉碎组。 使用一对显微外科剪刀创建切除组，从臂中 MN 的中心部分切除一个 10 mm 长的段。用8/0尼龙缝合线将神经的近端树桩进行修理，以防止斧头生长。 使用后一步中描述的 MN 的 10 mm 长段创建Graft组，并将其旋转 180°。使用中断的 10/0 尼龙缝将分段 MN 的近端和远端树桩缝合到神经移植物中。 使用中断的 5/0 尼龙缝10，,24关闭皮肤伤口. 提供术后甘蓝症与7 mL樱桃味对乙酰氨基酚与43 mL的自来水25混合，以获得浓度4.48毫克/mL在50 mL塑料水瓶提供给大鼠的内脏3天25。 2. 住房和物理治疗 允许大鼠在手术前2-4周与物理治疗器械接触，以确保更容易和更快地适应运动环境。按照下面详述的程序执行练习。 每天一次，将每只老鼠放在一个单独的物理治疗球内，然后把球体放在一个几乎没有障碍物的房间里。让老鼠畅游房间，自由探索半小时。 将老鼠单独放在单独的笼子里，用装有轮子的轮子来帮助它们锻炼。 形成4~5只动物群，并将这些动物安置在个性化的笼子里。通过包括梯子、绳索、运行轮和其他环境丰富元素来个性化笼子。 手术后的第二天，将单个大鼠送回个性化的笼子。 手术后3天恢复物理治疗练习。 3. 功能测试 在开始进行功能测试前一周，让大鼠熟悉食物，作为积极的强化。在成功完成每次测试后，在手术前后提供此强化。在3周的初始训练期后，在手术后1周恢复所有检查。 在晚上进行测试，当老鼠自然更活跃。手术后1周恢复检查。 执行抓取测试，把老鼠放在网格上，用尾巴抬起它，让它用它前爪11，26,26抓住网格。如果大鼠能用两个前爪抓住网格，则分配一个”正”分数。如果老鼠不能用受伤的爪子抓住网格，则分配一个”负”的分数。注：正抓取测试表明 MN 的电机部件运行16、,27。 执行针刺测试28，,29. 制作具有 4 mm x 4 mm 方形网格图案的塑料平台。使用 21 厘米长的金属框架支持此网格。 将大鼠放在平台上，用 15.5 厘米 x 15.5 厘米 x 11 厘米透明塑料盒盖住网格。等待几分钟，直到正常活动（例如，探索和主要梳理）消退。 当老鼠静止时，站在它的四只爪子上，开始测试。 在镜子的帮助下，插入一个麻醉仪（例如，弯曲力为25克的4号Von Frey头发），并在MN的皮肤区域戳出前爪的帕马面（图1）。在每个前爪上重复评估 5 倍，每次评估后等待几秒钟。 检查 Von Frey 灯丝30的弯曲是否正确。对退出反应进行评分如下：”0″，无退缩反应，”1″，如果大鼠慢慢地从灯丝中取出爪子，”2″，如果老鼠迅速响应刺激，取出爪子或舔爪子。注：如果观察到细丝的混点和咬，重复刺激，因为这些被认为是模棱两可的反应。 训练注意：每天训练大鼠3周，晚上在低光环境下做手术。特别推荐参加绳索攀岩、梯形梯和步行道测试的培训课程。这些可以按照之前介绍的顺序进行，从绳索攀爬测试开始，梯级运行，最后进行行走轨道测试。在新的测试之前，让同一动物休息几分钟。 在第一周，把老鼠放在梯子/绳索/走廊的最后三分之一，靠近盒子的入口。通过轻轻触摸和/或拉其尾巴的尖端，使动物向盒子打开的方向移动。一旦老鼠进入盒子，就给予它食物治疗，在重复测试之前，让老鼠休息几秒钟。每天重复5次，为期5天。 在第二周，把动物放在梯子/绳索/走廊的第二三分之二上重复步骤在3.5.1。 在第三周，将老鼠放在梯子/绳索/走廊的底部，放在盒子入口的对面。在 3.5.1 中重复这些步骤，但仅在动物正确完成测试后才奖励它。 执行梯形梯级测试。注：此测试用于评估前肢强度、步进、放置和协调31。 将大鼠放在梯子底部（120 厘米 x 9 厘米 x 2 厘米，18 步 1.5 厘米厚，间隔 4 厘米），轻轻触摸大鼠的尾巴。确保梯子置于 10° 的倾斜度，并在深色木制 31.5 厘米 x 35 厘米 x 35 厘米的盒面上打开 13.20 厘米 x 11 厘米。 一旦老鼠开始爬梯子，一旦老鼠的鼻塞穿过盒子的入口，就启动计时器。 记录时间并重复测试 3 倍，每个测试至少间隔 1 分钟。 绳索攀爬注：此测试用于评估抓握强度，这依赖于 MN 恢复32。 把老鼠放在绳子的底部，轻轻触摸尾巴，说服它爬起来。一旦动物开始攀爬，一旦老鼠的鼻线穿过平台的入口，就启动计时器。” 每次测试时，记录爬到平台所走的时间以及大鼠爬起绳索时受伤爪子的滑倒次数。如果动物在执行任务时没有犹豫或不会停止攀爬，则认为测试有效。正确执行任务后，为大鼠提供零食。 记录时间并重复测试 3 倍，每个测试至少间隔 1 分钟。 步行道注：本测试用于评估前肢运动恢复33，34。33, 设置一个设备，由16.5厘米的封闭走道组成，高度x8.7厘米的宽度x43厘米长。确保这导致一个矩形 8.8 厘米 x 8.2 厘米打开在黑色木质 23 厘米 x 36 厘米 x 28 厘米盒的墙壁之一。包括一个垂直滑动门，以快速关闭盒子的入口。包括一个可拆卸的顶部，用于检索大鼠33，34。33, 在走廊的地板上放一张图形纸。抓住老鼠的尾巴，让它拿着一个浸在亚甲蓝色油漆刷。将老鼠放在走廊的入口处，让它在箱子里行走。从走廊的地板上取下图形纸，重复测试，直到获得两个前爪的良好代表性印象。 从获得的打印件中，选择具有清晰连续前爪打印件的打印件，以 tiff 或 jpeg 格式拍摄它们，并使用开放访问软件 FIJI35测量以下参数。注：首先，使用图形纸中的标记校准每个图像（分析 |设置比例） 第二，将每个图像转换为 8 位格式 （图像 |类型 |8 位。随后，使用矩形选择工具选择爪打印。裁剪图像的这一部分（图像 |裁剪）。在每个图像中，通过阈值图像（图像 |调整 |阈值。 通过测量爪印面积测量姿势因子。使用矩形选择工具选择爪打印，然后按”控制 + M”。 测量打印长度因子，测量爪印的最长长度（对于步骤 3.8.3.2*3.8.3.6，使用直线选择工具选择两个最远点，然后按”控制 + M”。 通过测量爪印最宽的宽度来测量手指扩散因子。 通过测量第二和第三根手指之间的最宽宽度来测量中间手指扩散因子。 通过测量给定侧连续爪印的同源点之间的距离来测量步幅长度。 测量支撑的底座，测量爪印象中心部分与运动方向29、33、36之间的垂直距离。,33,36注：在两对具有代表性的连续双边爪印33中执行最后两个测量。 4. 生理测量 红外热成像（IRT）37，38，39. 使用热分辨率为0.1°C的普通数字水温计，确保进行测量的房间温度在18°C~25°C之间。确保不存在重要的热源（例如计算机或冰箱）。 在评估前 2 小时将大鼠带到评估室，使大鼠适应。在开始实验之前，按照上述步骤（步骤1.3_1.6）或按照机构的协议对大鼠进行麻醉。在开始实验之前，检查脚趾捏的响应不足。 在采集前 15 分钟打开红外热像摄像机，在评估期间不要将其关闭。设置相机的发射参数，以匹配大鼠皮肤的发射参数 （+ = 0.98）37，,40，,41。 用聚乙烯海绵将大鼠放在其多糖上，放在干净、稳定的表面上。确保没有反射材料和其他可能的文物来源。用双面胶胶带小心地固定前爪。在直肠内插入 2 厘米的数字温度计，以在所有评估期间监控大鼠的中心温度。 将热像相机保持 90° 角，距离大鼠 30 厘米。将相机聚焦整个动物的身体。获取间隔 30 s 的三张红外热成像图像。 将采集的热像传输到计算机，并使用分析软件进行分析。使用 MN 的平面区域（例如，9 x 11 像素）中的固定矩形区域（例如，在 MN 的块状脚垫中心）定义两个前爪的木板表面的温度（图 1）。使用免费的FLIR工具软件，通过双击选择热成像。在左侧工具栏上，选择按钮”添加框测量工具”，并在两个前爪的平面区域上绘制 9*11 像素的矩形。在调整矩形时，可以确认其尺寸（以像素为单位）。在两个前爪上执行。在图像的右侧找到最大、最小和平均温度。 在之前绘制的投资回报率上，右键单击并选择导出。然后，将 ROI 的温度平均值、最大值和最小温度以及温度矩阵导出到 .csv 文档中。这些数据以后可以使用数据分析软件进行浏览。 电子学学 （ENMG） 评价设置电气刺激器。胶带一对一次性针灸针针（0.25毫米x25毫米），阻抗可忽略不计[<1 Ω]），两者之间25毫米，形成刺激电极。现在，将刺激器和电极连接到数据采集单元，以接收传入信号并将其转换为数字信号，这些信号可以使用计算机软件进行处理。 在同一房间进行评估，并始终在相同的受控环境条件下进行 42、43、44 。42,43,44在开始数据采集之前，捏住前爪，确保大鼠被深度麻醉。注：深度麻醉对于尽量减少与大鼠自发自愿和/或非自愿运动相关的变异性至关重要。 在手术显微镜下暴露两侧的 MN，如步骤 1.8_1.13 所述。使用数字 15 手术刀刀片延长胸腔切口到前臂与心室中线切口。 通过使用虹膜剪刀直接分离上覆的骨筋膜，暴露屈肌数字升华肌肉的肤浅方面。将接地针插入左后肢的四头肌中，以连接信号接地塞。 从右前爪开始，将记录电极放入前爪的屈变器数字潜质肌肉腹部和刺激电极接近 MN 中的病变部位。用盐水润湿这些电极。 确保软件的设置如下：通道输入端口 1 （CH1） = 刺激器至 0-10 V;通道输入端口 2 （CH2） – EMG 至 30~1，000 Hz。首先选择 10 mV 的刺激振幅，并记录复合肌肉作用电位 CMAP 采样速率为 50 kHz，持续时间为 40，000 ms。以 10 mV 步长逐渐增加刺激振幅，直至达到 2，000 mV。,对左爪42、43、44,43重复相同。44注： 信号放大到 1，000 倍，并使用 30-1，000 Hz 频段进行过滤。刺激输出设置为单个脉冲，持续时间为 1 ms42，,43，,44。 打开录音设备软件中记录的文件。注：默认情况下，屏幕将以红色、刺激器脉冲和下面的蓝色显示拖窗。记录器 ENMG。在时间刻度下方滑动水平滚动条可以可视化完整记录。两个主要工具，缩放工具和 I-Beam 工具，位于面板的右下角。使用缩放工具，可以优化 CMAP 的可视化效果并浏览图形。为了保证可视化屏幕上的配合良好，缩放后可能需要调整显示屏。为此，请选择”显示” |自动缩放波形。I-beam 工具允许选择图形的特定区域以及所需测量的性能。在图形的顶部，有三个小窗口显示测量值。P-P以伏为单位显示所选区域的平均振幅值（在刺激器记录中和 ENMG 中），而Delta-T显示该选择的时间间隔。 使用软件插头中的”EMG中无监督分类的表格和作用电位工具”中的同质测量工具，测量复合肌肉作用电位（CMPA，表1所述）的参数。 对于每只大鼠，确定刺激电压的最小值，之后 CMAP 振幅不会进一步增加。从 0.05 mV 刺激开始，在 0.05 mV 的增量电压下连续增加刺激。 在此电压以上应用 20% 的刺激，以获得超值刺激值。 确定后一个值并应用相应的刺激后，记录下一个 CmAP 参数。 弹性强度评估 使用与步骤 4.2 相同的刺激器和刺激电极来电刺激 MN。将输入通道 CH1 设置为刺激器 （0~10 V）和 30 s 的刺激持续时间为 30 s 的输出设置，脉冲持续时间为 1 ms，频率为 1 Hz。将分辨率为 d = 0.001 N 的测功机连接到计算机。注：数据的实时可视化可以通过使用以前安装在计算机上的软件并将其链接到测功机46来构建每次力图 （N/s） 来获得。 放置步骤 4.1.4 中描述的大鼠。在两个前爪的第二个隔层空间放置一个5/0丝缝合环。将缝合环连接到测功机的钩子和前爪与测功机对齐，而不会对缝合线造成过大的压力。 用胶带固定反面爪子，以避免测功机读数中的杂散运动干扰。 单击”零”按钮将测功机设置为零。 通过调整电压结，将刺激器调整到 1.5 V 的超前振幅刺激。 在 PC 上，打开软件 AFH-01。打开分隔符”设备”并选择设备FH5。创建新文件（”度量值1″是默认给出的名称）并重命名该文件。 将电极放在 MN 的近端，单击程序底部的播放，记录测功机上的拉取 30 s。 将获取的值导入数据分析软件。计算每次评估的强度 x 时间图的最大和平均力值以及曲线 （AUC） 下的面积。 对左前爪重复上述步骤。 肌肉重量 在一般麻醉下，通过排泄47，48，使47,大鼠安乐死。 从两个前臂收获弯曲的鲤鱼径向肌肉，从其起源解剖肌肉，直到其远端肌腱插入，使用数字15手术刀刀片。 用精确刻度9，49,49的重量来称量肌肉。