Yetişkin fare basamak amputasyon ve rejenerasyonu: Mammalin Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için basit bir model

İnsanlar ve fareler de dahil olmak üzere memeliler, Terminal falanks (P3)^1,2,3distal amputasyon sonra rakamlarının ipuçlarını yeniden oluşturmak için kapasitesine sahip. Farelerde, rejenerasyon tepkisi amputation düzeyine bağlıdır; giderek proksimal basamaklı amputasyonlar, P3 çivi matrisine geçiş ve proksimal Amputasyonların tam rejeneratif yetmezliği^4,5,6 ' ya kadar aşamalı olarak zayıflatılmış rejeneratif tepkisi görüntüler ^{, 7 , 8}. P3 rejenerasyon bacağı yapıları yeniden oluşturmak için morfojenler oluşan Proliferasyona hücrelerin bir nüfus olarak tanımlanan bir blastema oluşumu ile arabulmalı⁹. Amputasyon ile kayıp yapıları yeniden oluşturmak için bir blastema oluşumu, bir süreç epimorphic yenilenme olarak adlandırılan, yaralanma sonra geleneksel doku onarımı çok doku düzeyinde P3 rejenerasyon yanıtı ayırt^{6, 10}. P3 rejenerasyon yara şifa¹¹,¹², kemik histoliz¹¹,¹²dahil karmaşık rejeneratif süreçleri araştırmak için tekrarlanabilir ve procedurally basit bir modeldir, revaskülarizasyon¹³, periferal sinir rejenerasyonu¹⁴, ve Intramembranous ossifikasyon yoluyla kemiğe blastemal dönüşümü¹⁵.

İmmunohistokimya kullanarak önceki çalışmalar blastema heterojen olduğunu göstermiştir, avasküler, hipoktik, ve yüksek proliferatif^11,13,15,16. Distal P3 amputasyonu sonrasında, erken blastema başlangıçta P3 periost ve endosteum ile ilişkilidir ve kemik yüzeyinin bitişiğinde sağlam proliferasyon ve nazcent osteogenezi ile karakterize edilir¹⁵. Kemik bozulması ve yara kapanışı sonrasında, heterojen blastema periosteal ve endosteal ilişkili hücrelerin birleşmesiyle oluşur, ardından Intramembranous ossifikasyon ^{yoluyla kemik dahil olmak üzere blastemal bileşenlerin farklılaşması 15 yaşında}.

Travmaya yanıt olarak kemik onarımı genellikle endokondral ossifikasyon tarafından oluşur, yani sonraki kemik oluşumu için bir şablon oluşturan ilk kıkırdak nasır üzerinden^17,18. Uzun kemik Intramembranous ossifikasyon, yani, bir kıkırdak ara olmadan kemik oluşumu, yaygın karmaşık distraksiyon cihazları veya cerrahi fiks kullanılarak indüklenir^19,20. Basamak rejenerasyon yanıtı konvansiyonel Intramembranous ossifikasyon modelleri üzerinde avantaj sunan bir ön klinik modeldir: 1) Intramembranous ossifikasyon uyarmak için dış veya iç fikresiyon sonrası yaralanma gerektirmez, 2) Her hayvandan 4 basamak kullanılarak gerçekleştirilen, böylece hayvanların kullanımını minimize ederken örnekleri maksimize, ve 3) sıralı in vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi (μCT) analizi kolay ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Bu çalışmada, yeniden üretilebilen ve sağlam bir rejenerasyon tepkisi elde etmek için standartlaştırılmış P3 amputasyonu düzlemini gösteriyoruz. Ayrıca, blastema oluşumu, rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyon ve Intramembranous yoluyla kemiğe blastemal dönüşümü görselleştirmek için parafin bölümlerini kullanarak optimize edilmiş bir floresan immünhistokimya Protokolü gösteriyoruz. Kemikleşme. Ayrıca, rejenerasyon sırasında aynı basamakta kemik morfoloji, hacim ve uzunluğundaki değişiklikleri belirlemek için sıralı in-vivo μCT kullanımını da gösteriyoruz. Bu protokolün amacı, Amputasyondan sonra memelilik blastema oluşumunu araştırmak ve Intramembranous kemik rejenerasyonunun incelenmesi için 2 Teknik, floresans immünhistokimya ve sıralı in vivo μct göstermektir.

Tüm hayvan kullanımı ve teknikleri, Texas A & M Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin standart çalışma prosedürlerine uygun olarak yapıldı.

1. yetişkin fare arka ekstremite distal P3 amputasyon

1. Anestezize bir 8 için 12 hafta-eski CD-1 fare (malzeme tablosu) oksijen Isoflurane gaz kullanarak; Başlangıçta bir odada% 3 ' te anesteziye, ardından ameliyat süresince bir burun konisi tarafından sağlanan% 2 isofluran. Anestezi altında kuruluğu önlemek için gözlerde oftalmik merhem uygulayın.
   Not: Laboratuvarımızda standardize edilen yetişkin P3 amputasyon çalışmaları 8 ila 12 haftalık fareler üzerinde gerçekleştirilir ve rejenerasyon tepkisi tüm test edilen suşlarında temin edilir.
2. Bir 10X diseksiyon mikroskop altında, cerrahi povidone ile arka ekstremite basamakları sterilize-iyot ve 70% etanol. Mikro-makas kullanarak cerrahi site uzak saç Trim. Cerrahi siteyi anesteziye almak için yerel olarak 1 μL topikal Bupivacaine uygulayın.
3. Terminal falanks (P3) distal ucunu, her bir arka ekstremite 2 ve 4 rakamında steril #10 neşter (Şekil 1a) kullanarak amputate. Amputasyon, cerrahi enstrümanların sterilizasyonu dahil olmak üzere aseptik koşullar altında yapılmalıdır. Diseksiyon mikroskop altında, yavaşça medial basamak yüzeyini açığa çıkarmak için arka pençe şevli. Şekil 1B'de gösterilen amputasyonu gerçekleştirmek için neşteri fatpad 'e paralel bir açıyla tutun. Amputasyon sitesine 1 μL topikal Bupivacaine uygulayın.
   Not: Amputasyon tırnak organı, dermis, P3 kemik, damar ve sinirler, ancak ilik boşluğu veya basamak yağ Pad Transect vermez. Kanama gözlenirse, steril bir pamuk ucu aplikatörü kullanarak doğrudan basınç uygulayın.
4. P3 kemik hacmi²¹' ın standart P3 distal amputasyon uçağı yaklaşık% 15 –% 20 ' sini kaldırır. Doğru amputasyon uzunluğunu onaylamak için MicroCT tarama (aşağıya bakınız) yapılabilir.
5. Fareyi temiz bir kafeye Geri dönün ve yaranın yara sosu olmadan iyileşmesine izin verin. Fareyi normal etkinliğe döndürmesini sağlamak için fareyi 3 gün boyunca izleyin.

2. basamak toplama ve doku hazırlama

1. Kapalı bir odada karbon dioksit (CO₂) kullanarak fareyi ötenize, ardından servikal dislocation.
2. Komşu kemik segmenti, orta fanx (P2) kemik, yaklaşık ikinci ventral yağ Pad girintisinde basamak orta yol koparmaya bir neşter kullanın. Basamağı (s) 10 mL taze tamponlu çinko formalin fiksatif,% 18 Formaldehit Çözeltisi (bkz. malzeme tablosu) Içeren 20 ml 'lik bir scintite şişeye aktarın. Fixative hacmi en az 20X doku mevcut hacmi olmalıdır.
   Not: Basamak tam rejenerasyon yanıtı araştırmak için amputasyon sonra çeşitli timepoints toplanır. Genellikle, erken blastema oluşumu için, kemik histolizi, ve yara kapanışı toplama timepoints 4 – 8 gün sonrası amputasyon (DPA). Erken osteojenik blastema araştırmak için toplama timepoints 9 ve 10 DPA, ve sürekli kemik yenilenme ve mineralizasyon görselleştirmek için, toplama timepoints 14, 21 ve 28 DPA vardır. Unamputated basamak da toplanır.
3. Bir shaker üzerinde nazik karıştırma ile Oda sıcaklığında 24 – 48 h için basamak düzeltin.
4. Fiksatif çıkarın ve oda sıcaklığında 5 ml 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 dk için 2x basamak yıkayın.
5. Yer 10 mL taze Decalcifier ı (bkz. malzeme tablosu),% 10 formik asit çözeltisi, scintite şişe ve hafifçe karıştırın bir shaker için 2 saat oda sıcaklığında. 2 saat sonra, taze çözelti ile Decalcifier ı değiştirin ve Shaker üzerinde nazik karıştırma ile Oda sıcaklığında gecede dekalit rakam.
6. Decalcifier ı 'yi çıkarın ve oda sıcaklığında 5 mL 1x PBS 'de 5 dk. 2x basamağı yıkayın.
7. Basamaklı bir etanol serisi ile basamak işlem. Bu süreç el ile yapılabilir 20 mL scintbrilasyon şişe, kullanarak 10 mL her sıvı az 40 toplam basamak.
   1. Başlamak ile 2 Immersions taze 70% etanol oda sıcaklığında bir shaker üzerinde nazik karıştırma, 1 h her, takip 2 Immersions taze 95% etanol oda sıcaklığında bir shaker üzerinde nazik karıştırma ile, 1 h her.
   2. Bir shaker üzerinde nazik karıştırma ile Oda sıcaklığında taze 100% etanol 2 yıkayıcı ile basamak dehidrasyon tamamlayın, 1 h her. Son 100% etanol yıkama gecede bırakılabilir.
8. Aynı scintbrilasyon şişede, 10 mL taze xylenes ile 100% etanol değiştirin ve oda sıcaklığında 1,5 h için bir kimyasal duman kaput içinde şişe yerleştirin. Toplam 2 yıkanıyor için oda sıcaklığında 1,5 h için bir kimyasal duman kaput içinde Ksilenler yeni bir yıkama ile tekrarlayın.
9. 68 °c ' ye eritilmiş sıvı Parafin balmumu ile Ksilenler değiştirin ve 2 saat, 2 kez için 68 °c ' de bir kuluçsa şişe yerleştirin. Parafin balmumu daldırma 4 Toplam h sonra, parafin seksiyonlama için basamak embed.
   Not: Histoloji için basamak işleme, aynı yönergeleri izleyerek otomatik bir işlemcide gerçekleştirilebilir.
10. Bir mikrotome kullanarak 4 – 5 μm kalınlığında kesit basamakları. Numunelerin kaydırmaya uymasını sağlamak için histolojik yapıştırıcı çözeltisi ile tamamlayıcı bir 38 – 41 °C su banyosunu kullanarak yapışkan slaytlara kesitli örnekler yerleştirin. 37 °C ' ye kaydırarak kurur.

3. Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için erişkin fare basamakları immünhistokimyasal boyama

1. 65 °C ' de 45 dakika için ısı kesitli slaytlar, ardından 37 °C ' de ısıtarak numunelerin kaydırağa uymasını sağlamak için 15 dakikadan az.
2. Deparaffinize ve 5 dk xylenes, bir dereceli etanol serisi, ve suda dalgıç yıkıyor 2x slaytlar rehydrate. Bir 50 – 100 mL kapasiteli boyama kavanozu içine slaytlar yerleştirin ve Tween 20 (TBST) ile 1x Tris tamponlu tuzlu içine batırma tutun.
   Not: Numunelerin boyama işlemi boyunca kurumasına izin verme. Herhangi bir TBST adımda, slaytlar 2 h kadar inkütenasyonlu olabilir.
3. Nemlendirme odası hazırlayın. 1-inç derin kapalı Plastik slayt kutusu ile nemlendirilmiş doku kağıdı tabanı yeterlidir.
4. Runx2, Osterix (OSX) ve proliferating hücre nükleer antijeni (PCNA) için ısı alma çözümünü hazırlayın. Erken osteoprojenitör Marker antijen alımı için, Runx2, Tris-EDTA, pH 8 bir 1x solüsyonu hazırlayın. Osteoblast marker için, OSX, bir 1 adet sitrat tampon solüsyonu hazırlayın, pH 6. PCNA immünostası her iki çözelti de gerçekleştirilebilir.
5. CXCR4²² ve endotel hücre Marker Von Willebrand factor 8 (vWf) için Mikrosantrifüjlü tüpte slayt başına 100 μL proteinaz k solüsyonu koyarak ve 37 °c ' ye Isıtma Için proteinaz k antijen alma çözümünü hazırlayın (yaklaşık 5 dk).
   Not: Runx2, OSX ve PCNA için antijen alımı ısı alımı kullanılarak gerçekleştirilir ve CXCR4 ve vWF antijen alımı proteinaz K tedavisi ile gerçekleştirilir.
6. Isı gerektiren antikor alımı için, uygun antijen alma çözeltisi içinde bir boyama kavanozu içine kayar. Isı 95 °C ' ye 25 dakika boyunca kaydırılarak kaynatılmasını sağlar. Isı kaynağından boyama kavanozu çıkarın ve 35 dk için oda sıcaklığında soğumaya izin.
7. Proteinaz k antijen alımı için, nemlendirme odasında düz slaytlar yatıyordu ve slayt üzerinde ön ısıtılmış proteinase K 100 μL yer. Slaytlar kuru hale gelmez sağlamak için Parafilm küçük bir şerit ile slaytlar kapak. 37 °C ' de 12 dakika boyunca slaytları kulyın.
8. Yıkama kaymaları 3 kez 5 dakika için 1x TBST içinde boya kavanozu sonra antijen alma.
9. Boyama kavanozu ve yer nemlendirme odasına slaytlar çıkarın. Slayt üzerinde 6-7 damla engelleme çözeltisi (malzeme tablosu) yerleştirin ve slayt kuru hale gelmez sağlamak için taze parafin film ile slayt kapak. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca slaytları kulyın.
10. Antikorları antikor seyreltme (malzeme tablosu) içine seyreltilerek primer antikorları hazırlayın. Her primer antikor çözeltisi 3 s için Vortex. farklı konak türlerinden elde edilen primer antikorlar birleştirilebilir.
    Not: Runx2 için immunohistokimyasal boyama (tavşan Anti-Runx2 antikor, 1:250 seyreltme, son konsantrasyon 4 μg/mL) PCNA ile birlikte (monoklonal fare Anti-PCNA antikor, 1:2000 seyreltme, son konsantrasyon 0,5 μg/mL), ve OSX (tavşan Anti-OSX antikor, 1:400 seyreltme, son konsantrasyonda 0,125 μg/mL) PCNA ile birlikte Şekil 2' de gösterilir. Bu çalışmada kullanılan fare Anti-PCNA antikor son derece özeldir ve bu protokolde özetlenenlerin ötesinde ek engelleme adımları gerektirmez. CXCR4 (Rat Anti-CXCR4 antikor, 2 μg/mL son konsantrasyonunda 1:500 seyreltme) ve vWF (tavşan karşıtı vWF VIII antikor, 1:800 seyreltme, son konsantrasyon 41,25 μg/mL) kullanarak immünohistokimyasal boyama Şekil 2' de gösterilir. Primer antikorlar bu protokoldeki koşullar altında laboratuvarımız tarafından optimize edilmiş ve test edildi ve malzeme tablosundalistelenmiştir.
11. Dikkatle parafin filmi kaldırmak ve hafifçe aşırı engelleme çözümü kaldırmak için doku kağıdı üzerine slayt boşaltma. Slayt üzerinde 100 – 200 μL primer antikor çözeltisi yerleştirin, Parafilm kapağını değiştirin ve nemlendirme odasına dönün. Kapalı nem alma odasında, gece 4 °C ' de slaytları kulvatın.
    Not: Engelleme çözümünü boşaltırken slaytların kuru olmasına izin vermeyin. Bu adım hızlı bir şekilde gerçekleştirilir.
12. Dikkatle Parafilm kaldırmak ve yavaşça slayttan birincil antikor solüsyonu drenaj. Slayt yeni 1X TBST içeren bir boyama kavanozu yerleştirin. 5 dakika 3 kez taze 1x TBST ile yıkayın.
13. İkincil antikorları antikor seyreltilmesiyle (malzeme tablosu) birleştirerek hazırlayın. 3 s için ikincil antikor çözeltisi Vortex. farklı türlerinden elde edilen farklı fluorophorlere konjudi Ikincil antikorlar kombine edilebilir.
    Not: Floresan ikincil antikorlar hafif duyarlıdır. Alexa Fluor 488-Conjugated keçi Anti-tavşan IgG (H + L) Runx2 için, OSX, ve vWF, Alexa Fluor 568-Conjugated keçi Anti-Rat IgG (H + L) CXCR4 için, ve Alexa Fluor 647-konjuli keçi Anti-Mouse IgG (H + L) PCNA için, 4 μg/mL son konsantrasyonu ile 1:500 ' de seyreltilmiş Şekil 2' de kullanıldı.
14. Slayt üzerinde ikincil antikor çözeltisi μL 200 yer, taze parafin film ile kapak slayt, ve nemlendirme odasına dönün. Kapalı nemlendirme odasındaki slaytları, oda sıcaklığında 45 dakika süreyle kulvatın. Nemlendirme odasının ışığı önlemek için kapalı olduğundan emin olun.
15. Dikkatle parafin filmi kaldırmak ve hafifçe slayt ikincil antikor solüsyonu drenaj. Slayt yeni 1x TBST içeren bir boyama kavanozu yerleştirin. 5 dk 3x için taze 1x TBST ile yıkayın. Işık kaçının.
16. Nükleer leke hazırlayın. 20 μL DAPı ekleyin (stok DAPı çözümü 5 mg/mL H₂O) Için 200 ml 1x PBS ve homojenliği sağlamak için şiddetle sallayın. DAPı-PBS çözümünde 5 dakika boyunca kaydırmaları bırakın. Işık kaçının.
17. DH₂O 'da 3 dk. su ile yıkayın ve slaytların havalandırmaya izin vermesini sağlar ve suyun süpürme sırasında bozulmasına neden olur. Işık kaçının.
18. 100 μL Anti-Fade montaj ortamını kullanarak dikkatle lamel magazini kuru slaytlar (malzeme tablosu); Montaj adımı sırasında slayt üzerinde hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek. Slaytları düz saklayın ve montaj ortamının, ışık geçirmez bir konteynerdeki oda sıcaklığında bir gecede kurumasını bekleyin. Montaj ortamı kuru olduktan sonra, slaytları 4 °C ' de ışık geçirmez bir kabın içine düz olarak saklayın.
    Not: Montajdan sonra hava kabarcıklarının kabul edilemez seviyeleri mevcutsa, monte edilen slayt hafifçe 1x PBS 'ye yerleştirilebilir, lamel magazini çıkarılabilir ve slayt tekrar suya durulanır ve yeniden kurutulur, yeniden monte edilebilir.

4. mikroskobik ve görüntü analizi

Not: Bir floresan deconvolution mikroskop ve ilişkili yazılım kullanarak görüntüleme ve analiz, 3 floresan filtreleri ile donatılmış (Alexa Fluor 488, 568 ve 647 nm sinyalleri görselleştirmek için), artı DAPı (419 Nm) Bu deneyde kullanılır.

1. Tüm blastema bölgesini yakalamak için slayt 10X büyütme görüntü.
   Not: Proliferating osteoblast primer antikor algılama ikincil antikorlar kullanır (Alexa Fluor 488 ve 647) ortak etiketli hücrelerin yanlış kimliğini en aza indirmek için çakışan olmayan emisyon spektrumlu. 488 veya 647 sinyallerinin bütünlüğünü sağlamak için 568 nm filtre kullanılarak otofloresan sinyalinin arka planda çekilmesi yapılabilir. Blastema primer antikor algılama ikincil antikorlar kullanır (Alexa Fluor 488 veya 568). 488-konjuli antikor kullanıldığında 568 filtresinin arka planda otofloresan sinyalinin geri çekilmesi ve 488 filtre, 568-konjuli antikor kullanılarak yapılabilir. Autofluorescent sinyal genellikle rakam boyunca tırnak plakası ve eritrositler ile ilişkilidir ve 488, 568 ve 647 filtreler görülür.

5. sıralı In vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi (μCT)

1. Amputasyon (amputasyonlu), 1 DPA öncesi ve çeşitli zaman noktalarında 1 gün önce taranmış aynı hayvanın rejenere basamakları, vivaCT 40 (malzeme tablosu) kullanılarak 28 DPA 'da tam rejenerasyon gerçekleştirilinceye kadar, bu denemede Şekil 3A.
2. Μct 'i, μCT hayvan odasının içine ve dışına oksijen akışını sağlamak için boru ile donatın ve dışarı akan oksijenin ısofluran 'ı tuzağa düşürmek için aktif bir kömür filtresine sahip olmasını sağlar.
   Not: ΜCT hayvan odasının sıkıca kapalı olduğundan emin olun; Bu şekilde, bir hayvan burun-koni tarama sırasında fareye izofluran sağlamak için gerekli değildir.
3. ΜCT tarama parametrelerini hazırlayın. Rakamlar 10,5 μm ' lik bir Voksel boyutunda, 55 KVP, 145 UA, sürekli rotasyon kullanarak 180 ° başına 1000 projeksiyonlarla ve 200 msec entegrasyon süresi ile tarama başına en fazla 213 dilim ile taranır. Bu denemede gerçekleştirilen taramalar yaklaşık 9 dakika uzunluğunda. Azaltılmış elektrik akımı orantılı olarak artan entegrasyon süresi ile telafi edilebilir ancak daha uzun tarama süreleri neden olur.
4. Isoflurane kullanarak yetişkin fare anestezize; Başlangıçta bir odada% 3 ' te anesteziye sonra, tarama süresince μCT hayvan odasına% 1,5 ısofluran verilir. Hafifçe yakın dernek, düz, ventral yan-yukarı sol pençe ve sağ tarafta tarama platformu üzerinde sağ pençe ile düzenlenmiş arka ekstremite basamakları ile μCT hayvan odasına fareyi yerleştirin, yavaşça cerrahi kullanarak yerinde basamak güvenliğini takip Teyp. Anestezi altında kuruluğu önlemek için gözlerde oftalmik merhem uygulayın.
5. Fareyi temiz bir kafeye dönün ve fareyi uyanık olana kadar izleyin. Tüm kemik rejenerasyon tepkisi görselleştirmek için haftalık zaman noktalarında iki haftalık olarak aynı fareyi tarama devam edin.
6. Tarama işleminden sonra, μCT görüntü yeniden yapılanma işleminin gerçekleşmesi için birkaç saate kadar izin verin. Μct ile birlikte verilen yazılımı kullanarak, dosyaları bir dizi DICOM dosyalarına dönüştürün; Her DICOM dosya tarama bir dilim karşılık gelir, bu nedenle, 213 dilim tarandığında, 213 DICOM dosyaları oluşturulur ve şirketin sunucusuna yüklenir.
7. Bir Web tarayıcısında bir toplu iş dosyası Downloader kullanarak tek bir klasörde DICOM serisi indirin.
8. Download BoneJ eklentisi²³ ve ımagej Plugin klasörüne dosyayı sürükleyin. Imagej 'de, klasörü ımagej çubuğuna sürükleyerek ve bırakarak bir yığın olarak DICOM dosya serisini açın. Tüm gri değerleri görüntüleyen 16 bitlik görüntü yığını açılacaktır. Sadece kemik görüntülemek için, görüntü eşik gerçekleştirin (IMage > > eşikayarlayın).
   Not: Imagej dosyalarını görüntülerken, ımagej çıktısı basamakların tersine çevrilmiş bir görüntüsüne karşılık gelir; Yani, basamak tarama platformunda düzenlenmiş ventral yan-up, platformun sağ tarafında platform ve sağ pençe solda sol pençe ile, dorsal yan-up olarak görünecektir, sol tarafta sağ pençe ve ımagej görüntü yığınının sağ tarafında sol pençe.
9. Eşik iletişim kutusu açıldığında, alt çubuğu, üst eşiğe karşılık gelen sağa doğru kaydırın ve yalnızca kemik kırmızı vurgulanır kadar alt eşik karşılık gelen üst çubuğunu ayarlayın. Düşük eşik değeri, 32.767 maksimum sinyal yoğunluğunda yaklaşık 10000 – 13000 olacaktır. Uygula'yı tıklatın ve yeni iletişim kutusunda siyah arka plan'ı tıklatın. Tamam'ı tıklatın.
10. Siyah ve beyaz değerleri görüntüleyen 8 bitlik bir görüntü, kemiğe karşılık gelen beyaz ile oluşturulur. Seçin P3 kemik etrafında bir dikdörtgen çizerek ve yığını çoğaltmak. 3B görüntü oluşturun (eklentiler ≫ 3B görüntüleyici). Görüntüden gereksiz herhangi bir kemik kırpmak için, serbest seçim aracını tıklatın ve silinecek kemiği daire. Sağ tıklayın ve kemiği silmek için Dolgu seçimi 'ni seçin.
    Not: Yukarıda açıklanan adımlar ımagej 1.52 h, Java 8 için geçerlidir ve ımagej 'nin farklı bir sürümünü kullanırken biraz farklılık gösterebilir. Thresholding için, en uygun değeri belirlemenizi ve bu değeri tutarlı bir şekilde kullanmanızı öneririz.
11. BoneJ Volume kesir Plugin (Plugins ≫ Bonej > Volume kesir) kullanarak 3D render gelen kemik hacmi ölçmek. Bir sonuç penceresi görünecektir ve kemik hacmi (BV) mm³' te görüntülenir.
12. Imagej MultiPoint aracını kullanarak kemik uzunluğunu 3B işlemeden ölçün.
    Not: Kemik uzunluğu P3 rejenerasyon süresince dinamiktir; uzunluğu 7-10 arasında azalır, osteoklast-mediated kemik bozulması¹¹ile ilişkili DPA, ve bir distal kemik gerilme dönemi tarafından takip edilir 14-28 DPA (Şekil 3B). Uzunluk, P2/P3 ekleminin merkezi tabanına distal kemik ekinde Mineralizasyonun en uzak noktasına kadar ölçülür, ancak tamamen ayrılmış olan bozulmuş kemik içermez (Şekil 3B). BoneJ kemik mimarisinin tam 3D değerlendirmesi için izin verir; Böylece, kemik taranır açısı uzunluğunu ölçmek için yeteneğini değiştirmez.
13. Görüntüle'yi tıklatarak ve anlık görüntü almak için 3B işleme görüntüsünü yakalayın. Görüntüyü bir tif veya JPEG dosyası olarak kaydedin.

6/7 DPA (Şekil 2a-D), 9 DPA (Şekil 2e-H) ve 10 DPA (Şekil 2i-L) ' de P3 basamakları rejenere yetişkin fare, Runx2, OSX ve PCNA antikorları ile immünosteli Intramembranous kemik görselleştirmek için rejenerasyon ve CXCR4 ve vWF antikorları ile immünostasyon blastema oluşumu görselleştirin. Amputasyon öncesinde taranan basamak ve yenilenme sırasında çeşitli zaman noktalarında (Şekil 3A, B) temsili μct render ve uzunluk ölçümlerini belirlemek için kullanılan simge yapılarının tanımlanması (Şekil 3B) da gösterilir.

Şekil 1: basamaklı sayı ve yetişkin fare distal P3 amputasyon uçağı tanımlaması. Yetişkin fare sağ arka pençe 1-5 sayılı basamak ile gösterilir; Bu çalışmada yapılan amputasyonlar 2 ve 4 (A) basamak üzerinde gerçekleştirilir. Distal P3 amputasyon uçağı 2 ve 4 (B) basamağında (kesikli çizgi) gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: erken Intramembranous ossifikasyon ve rejenere yetişkin fare P3 haneli blastema oluşumu. Runx2 (yeşil) ve PCNA (macenta) çift immünofluorescence, proliferasyon osteoprojenenlerin ilk olarak 6/7 DPA 'da periosteal ve endosteal kemik yüzeylerine lokalizedir ve 9 ve 10 DPA 'da distal blastema (A, E, ı) ' ye genişletilir. OSX (yeşil) ve PCNA (macenta) çift immünofluorescence, 6/7 (B) ' de birkaç OSX-pozitif osteoblastları ve geniş proliferasyonu ve 9 ve 10 DPA 'da (F, J) proliferasyon hücreleri tarafından distale olarak sınırlıdır. CXCR4 (kırmızı) immünofluoresesans, 6/7 DPA (C) ' de erken blastema oluşumunu tanımlar ve ardından 9 ve 10 DPA rejenere rakamında (G, K) sağlam CXCR4 immünostasyon takip eder. vWF (yeşil) immünostasyon, amputasyonlu basamakların iliğinde bozulmamış damarlarını ve avasküler blastema ile ilişkili birkaç pozitif hücreyi (D, H, L) tanımlar. Örnekleri DAPı ile Counter,. Dorsal üstte, distal sağda. BL = blastema, m = iliği. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Şekil 3: sıralı in-vivo μCT tarama ile görüntülenen P3 kemik rejenerasyonu. Amputasyon (unamp) öncesinde ve 1, 7, 10, 14, 21 ve 28 DPA 'da taranan bir basamak temsili μCT render. μCT tarama P3 rejenerasyon ilk kemik histoliz tepkisi ile karakterize olduğunu göstermektedir, 14 DPA kemik Adası oluşumu ve 21 ve 28 DPA (A) sağlam kemik rejenerasyon sonra. Amputasyon öncesinde taranan bir basamak ve 1, 7, 10, 14, 21 ve 28 DPA 'da basamak uzunluğunun her zaman noktasında ölçüldüğü bölgeleri gösteren temsilci μCT render. (B) yeşil noktalar ölçülen toplam uzunluğu belirtmek, kırmızı X uzunluğu ölçümü hariç atılan kemik bölgesini gösterir ise. Imagej tarafından oluşturulan bireysel basamak görüntüleri bu rakam görülen görüntülerin oluşturulmasını sağlamak için basamak boyutunu standartlaştırmak için kırpılmış olabilir. Distal sağda, dorsal üst. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Bu protokol, Yetişkin fare distal P3 Amputasyonunun standartlaştırılmış bir prosedürünü, blastema oluşumunu ve Intramembranous ossifikasyonu görselleştirmek ve araştırmak için floresan immünhistokimyasal boya, ve sıralı in-vivo μct taramasını açıklar kemik morfolojik, hacim ve uzunluk değişiklikleri amputasyon sonrası tanımlayın. P3 amputasyonu, blastema oluşumunu tetikleyen bir rejeneratif yara ortamını analiz etmek için benzersiz, prosedüre basit ve tekrarlanabilir bir modeldir. Ayrıca, P3 basamak modeli, Intramembranous ossifikasyon araştırmak için geleneksel kemik hasarı modelleri üzerinde sayısız avantaj sunar.

Bu protokolün başarısını sağlamak için, tam basamak kireç çözmesi yapılmalıdır. Rakam tamamen decalcified değildir durumunda, bu parçalama ve parçalama işlemi sırasında parçalamak olacaktır. Ayrıca, ısı alımı immünhistokimya dokularda biraz ayırabilir veya tamamen slayttan yerinden hale olabilir sorunlu olabilir. Bu sorunu hafifletmek için, numuneler, bir histolojik yapıştırıcı maddesi ile tamamlayıcı bir su banyosu kullanarak yapışkan slaytlar üzerine monte edilmelidir, yanı sıra kullanmadan önce 65 °C kuru kaydırakları pişirme. Son olarak, fare basamakları nispeten küçüktür; Bu nedenle, morfolojisi doğru görselleştirmek ve kemik hacmi ve uzunluğundaki değişiklikleri ölçmek için, μCT uygun tarama parametrelerinde çalışabilmek için yeterli çözünürlüğe sahip olmalıdır.

Bu yöntemin bir sınırlama tüm primer antikorlar doku fikreme ve parafin işleme ile uyumlu değildir. Bu durumda, primer antikor antijen¹¹bütünlüğünü sağlamak için standart dondurulmuş doku kriyobölümleme yapılabilir. Donuk kesit de kireç çözücü adım ihtiyacını ortadan kaldırır, ancak biz rakamlardan donuk kesit Teknik olarak daha parafin bölümlenme daha zorlu olduğunu bulduk.

Tüm blastema, deconvolution mikroskopisi ile 10X büyütmede görselleştirilebilir ve uygun görüntü ölçümleştirme yazılımını kullanarak immünostalize edilen sonuçlar kolayca ölçülebilir. Rejenere basamağının osteojenik belirteçleri için floresan immünhistokimya problama Intramembranous ossifikasyon ile blastemal farklılaşma benzersiz bir görünüm sağlar. İmmunohistokimyasal boya, P3 kemik rejenerasyon tepkisi polarize olduğunu ortaya çıkarır ve organize proksimal-distal kemik oluşumuna neden olur (Şekil 2). Daha sonra rejenerasyon aşamalarında, blastema türetilmemiş proliferatif osteoblastlar kemik kütüğün bitişiğinde lokalizedir ve proliferasyon osteoblastlar tarafından distale sınırlıdır. Proliferasyon osteoblastlar, sırayla, farklılaşılmamış blastemal hücreler Proliferasyona tarafından distale sınırlıdır. CXCR4 blastema işaretçisi için floresan immünhistokimya problama, yaralı kemik yüzeyiyle ilişkili erken blastema hücrelerini, ardından rejenerasyon aşamalarında gelişmiş immünostasyonu takiben tanımlar (Şekil 2). Blastema, avasküler¹³ ve immünofluoresesans için endotel hücre Işaretçisi VWF blastema bölgesi içinde birkaç pozitif hücreleri tanımlar (Şekil 2).