Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek
Summary
Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.
Abstract
Talrijke intracellulaire eiwitten communiceren fysiek in overeenstemming met hun intracellulaire en extracellulaire omstandigheden. Inderdaad, cellulaire functies grotendeels afhangen van intracellulaire eiwit – eiwit interacties. Daarom is onderzoek met betrekking tot deze interacties onmisbaar om het begrijpen van fysiologische processen te vergemakkelijken. Co-precipitatie van geassocieerde eiwitten, gevolgd door massaspectrometrie (MS) analyse, maakt het mogelijk nieuwe eiwit interacties te identificeren. In deze studie hebben we details gegeven over de nieuwe techniek van Immunoprecipitation-vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS-analyse in combinatie met on-membraan vertering voor de analyse van eiwit-eiwit interacties. Deze techniek is geschikt voor ruwe immunoprecipitanten en kan de doorvoer van proteomische analyses verbeteren. Gelabelde recombinant eiwitten werden neergeprecipiteerd met specifieke antilichamen; vervolgens werden immunoprecipitanten die op polyvinylideendifluoride membraan stukken werden geblopt, onderworpen aan reductieve alkylatie. Na trypsinisatie werden de verteerde proteïne residuen geanalyseerd met LC-MS/MS. met behulp van deze techniek, waren we in staat om verschillende kandidaat-geassocieerde eiwitten te identificeren. Deze methode is dus handig en nuttig voor de karakterisering van nieuwe proteïne-eiwit interacties.
Introduction
Hoewel eiwitten een constitutieve rol spelen in levende organismen, worden ze voortdurend gesynthetiseerd, verwerkt en afgebroken in de intracellulaire omgeving. Bovendien, intracellulaire eiwitten vaak fysiek en biochemisch interactie, die de functie van een of beide1,2,3beïnvloedt. Bijvoorbeeld, de directe binding van spliceosome-geassocieerde proteïne homo CWC22 met eukaryotische omzettings initiatie factor 4a3 (eIF4A3) is noodzakelijk voor de assemblage van de Exon Junction complex4. Consistent met deze, een eIF4A3 mutant die niet affiniteit voor CWC22 niet in slaagt om Exon Junction complex gestuurde mRNA splicing4te faciliteren. Zo is de studie van eiwit interacties cruciaal voor het precieze begrip van fysiologische regulering en van cellulaire functies.
Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) zijn toegepast op de uitgebreide analyse van eiwit-eiwit interacties. Bijvoorbeeld, de co-precipitatie van endogene eiwitten of exogenously introduceerde gelabelde eiwitten met hun geassocieerde eiwitten, gevolgd door MS-analyse, maakt de identificatie mogelijk van nieuwe eiwit interacties5. Een belangrijk knelpunt bij MS/MS-analyses is echter een slecht herstel van tryptische vergisters van eiwit monsters. Voor het uitvoeren van proteomische analyses op cellysaten worden in het algemeen in-gel en op membraan vergistings technieken gebruikt om MS/MS-monsters voor te bereiden. We hebben eerder een in-gel vergistings procedure vergeleken met een on-membraan vergistings techniek6, en toonden aan dat deze laatste gepaard ging met een betere sequentiedekking. Polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan kan geschikt zijn voor dit doel, omdat het mechanisch robuust en bestand is tegen hoge concentraties van organische oplosmiddelen7,8, waardoor de enzymatische vertering van geïmmobiliseerde eiwitten in aanwezigheid van 80% acetonitril9. Bovendien kan immobilisatie op een membraan conformationele veranderingen in doel eiwitten veroorzaken, wat leidt tot verbeteringen in de efficiëntie van tryptische spijsvertering10. Dienovereenkomstig hebben we in dit artikel het gebruik van Immunoprecipitation-LC/MS/MS-analyse van eiwit interacties beschreven met behulp van een verterings techniek op het membraan. Deze eenvoudige methode vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties, zelfs in niet-gespecialiseerde laboratoria.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben eerder beschreven een analyse van de oxidatieve modificaties van apolipoproteïne B-100 in geoxideerde low-density lipoproteïne met behulp van LC-MS/MS voorafgegaan door een op-membraan spijsvertering techniek6. In de huidige studie, we combineerden deze techniek met immunoprecipitatie en hebben verschillende calpain-6-geassocieerde eiwitten geïdentificeerd. Deze nieuwe techniek vertegenwoordigt een handige methode voor het screenen van kandidaat-geassocieerde eiwitten. Calpain-6 is ee…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd deels gesteund door Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI subsidie nummer 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI subsidie nummer 15K09418 (TM), een onderzoeksbeurs van Kanehara Ichiro Medical Science Foundation en een onderzoeksbeurs van Suzuken Memorial Foundation (all to TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
Referências
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
