Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para una técnica de digestión en la membrana para la preparación de muestras para espectrometría de masas. Esta técnica facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína.
Abstract
Numerosas proteínas intracelulares interactúan físicamente de acuerdo con sus circunstancias intracelulares y extracelulares. De hecho, las funciones celulares dependen en gran medida de las interacciones proteína-proteína intracelular. Por lo tanto, la investigación sobre estas interacciones es indispensable para facilitar la comprensión de los procesos fisiológicos. La co-precipitación de proteínas asociadas, seguida de un análisis de espectrometría de masas (EM), permite la identificación de nuevas interacciones proteicas. En este estudio, hemos proporcionado detalles de la novedosa técnica de la cromatografía inmunoprecipitada-líquido (LC)-MS/MS combinado con la digestión en la membrana para el análisis de interacciones proteína-proteína. Esta técnica es adecuada para inmunoprecipitados crudos y puede mejorar el rendimiento de los análisis proteómicos. Las proteínas recombinantes etiquetadas se precipitaron utilizando anticuerpos específicos; a continuación, los inmunoprecipitados borrados en piezas de membrana de difluoruro de polivinilideno fueron sometidos a alquilación reductiva. Después de la tripinización, los residuos de proteínas digeridas se analizaron utilizando LC-MS/MS. Usando esta técnica, pudimos identificar varias proteínas asociadas candidatas. Por lo tanto, este método es conveniente y útil para la caracterización de nuevas interacciones proteína-proteína.
Introduction
Aunque las proteínas desempeñan un papel constitutivo en los organismos vivos, se sintetizan, procesan y degradan continuamente en el entorno intracelular. Además, las proteínas intracelulares interactúan con frecuencia física y bioquímicamente, lo que afecta a la función de uno o ambos1,2,3. Por ejemplo, la unión directa del homólogo proteico asociado al esferoctico CWC22 con el factor de inicio de latraslación eucariota 4A3 (eIF4A3) es necesaria para el montaje del complejo de unión de exón 4. En consonancia con esto, un mutante eIF4A3 que carece de afinidad por CWC22 no facilita el empalme de ARNm impulsado por el complejo de cruces de exón4. Por lo tanto, el estudio de las interacciones proteicas es crucial para la comprensión precisa de la regulación fisiológica, así como de las funciones celulares.
Los avances recientes en espectrometría de masas (EM) se han aplicado al análisis exhaustivo de las interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, la co-precipitación de proteínas endógenas o proteínas etiquetadas introducidas exógenamente con sus proteínas asociadas, seguida según el análisis de la EP, permite la identificación de nuevas interacciones proteicas5. Sin embargo, uno de los principales cuellos de botella del análisis de la SM/MS es la mala recuperación de los resúmenes trípticos de las muestras de proteínas. Para realizar análisis proteómicos en los lysatos celulares, generalmente se emplean técnicas de digestión en gel y en membrana para preparar muestras de MS/MS. Hemos comparado previamente un procedimiento de digestión en gel con una técnica de digestión en la membrana6, y hemos demostrado que este último se asoció con una mejor cobertura de secuencia. La membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) puede ser adecuada para este fin, ya que es mecánicamente robusta y resistente a altas concentraciones de disolventes orgánicos7,8, lo que permite la digestión enzimática de inmovilizados proteínas en presencia de 80% acetonitrilo9. Además, la inmovilización en una membrana puede inducir cambios de conformación en las proteínas diana, lo que conduce a mejoras en la eficiencia de la digestión tríptica10. En consecuencia, en este artículo, hemos descrito el uso del análisis de inmunoprecipitación-LC/MS/MS de interacciones proteicas utilizando una técnica de digestión en la membrana. Este sencillo método facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína incluso en laboratorios no especializados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito previamente un análisis de las modificaciones oxidativas de la apolipoproteína B-100 en lipoproteínas oxidadas de baja densidad utilizando LC-MS/MS precedida por una técnica de digestión en membrana6. En el presente estudio, combinamos esta técnica con la inmunoprecipitación y hemos identificado varias proteínas asociadas al calpain-6. Esta novedosa técnica representa un método conveniente de detección de proteínas asociadas a los candidatos. Calpain-6 es un miembro no p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI Grant Number 17K09869 (a AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), una beca de investigación de Kanehara Ichiro Medical Science Foundation y una beca de investigación de Suzuken Memorial Foundation (todo a TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
Referências
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
