एक पर झिल्ली पाचन तकनीक का उपयोग कर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन का मूल्यांकन
Summary
यहाँ, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूने की तैयारी के लिए एक पर झिल्ली पाचन तकनीक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस तकनीक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के सुविधाजनक विश्लेषण की सुविधा.
Abstract
कई इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन शारीरिक रूप से उनके इंट्रासेल्यूलर और एक्स्ट्रासेल्यूलर परिस्थितियों के अनुसार बातचीत करते हैं। वास्तव में, सेलुलर कार्य काफी हद तक intracellular प्रोटीन प्रोटीन प्रोटीन बातचीत पर निर्भर करते हैं. इसलिए, इन बातचीत के बारे में अनुसंधान शारीरिक प्रक्रियाओं की समझ को सुविधाजनक बनाने के लिए अपरिहार्य है. संबद्ध प्रोटीन की सह-वर्षा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के बाद, उपन्यास प्रोटीन बातचीत की पहचान सक्षम बनाता है. इस अध्ययन में, हमने प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए ऑन-मेम्ब्रेन पाचन के साथ संयुक्त इम्यूनोवेसिशन-तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी)-एमएस/एमएस विश्लेषण की उपन्यास तकनीक का विवरण प्रदान किया है। यह तकनीक कच्चे इम्यूनोप्रिसिटेंट के लिए उपयुक्त है और प्रोटीओमिक विश्लेषणों के थ्रूपुट में सुधार कर सकती है। टैग की गईं पुनः संयोजक प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर वेग थे; अगले, इम्यूनोप्रिसिटिडेंट्स ने पॉलीविनाइलिडेन डाइफ्लोराइड झिल्ली के टुकड़ों पर दाग लगाया था, जो रिडक्टिव ऐल्किलेशन के अधीन थे। trypsinization के बाद, पचा प्रोटीन अवशेषों LC-MS/MS का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. इस तकनीक का उपयोग कर, हम कई जुड़े प्रोटीन की पहचान करने में सक्षम थे. इस प्रकार, इस विधि सुविधाजनक और उपन्यास प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की विशेषता के लिए उपयोगी है.
Introduction
हालांकि प्रोटीन जीवित जीवों में संरचक भूमिका निभाते हैं, वे लगातार संश्लेषित कर रहे हैं, संसाधित, और intracellular वातावरण में अपमानित. इसके अलावा, इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन अक्सर शारीरिक और जैव रासायनिक रूप से बातचीत करते हैं, जो एक या दोनों1,2,3के कार्य को प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, यूकैरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 4A3 (eIF4A3) के साथ spliceosome-संबद्ध प्रोटीन समलॉग CWC22 का प्रत्यक्ष बंधन एक्सोन जंक्शन परिसर4की विधानसभा के लिए आवश्यक है। इस के साथ संगत, एक eIF4A3 उत्परिवर्ती कि CWC22 के लिए आत्मीयता का अभाव है एक्सन जंक्शन जटिल संचालित MRNA splicing4की सुविधा में विफल रहता है. इस प्रकार, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन शारीरिक विनियमन की सटीक समझ के साथ ही सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है.
मास स्पेक्ट्रोमेट्री में हाल ही में अग्रिम (एमएस) प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के व्यापक विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है. उदाहरण के लिए, अंतर्जात प्रोटीन या exogenously उनके जुड़े प्रोटीन के साथ टैग प्रोटीन की सह वर्षा, एमएस विश्लेषण के बाद, उपन्यास प्रोटीन बातचीत की पहचान5सक्षम बनाता है. तथापि, एमएस/एमएस विश्लेषण की एक प्रमुख बाधा प्रोटीन नमूनों के ट्रिप्टिक डाइजेस्ट से खराब वसूली है। सेल lysates पर प्रोटीओमिक विश्लेषण के संचालन के लिए, इन-जेल और पर झिल्ली पाचन तकनीक आम तौर पर एमएस / हम पहले एक पर झिल्ली पाचन तकनीक6के साथ एक में जेल पाचन प्रक्रिया की तुलना में है, और पता चला है कि बाद बेहतर अनुक्रम कवरेज के साथ जुड़ा हुआ था. Polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त हो सकता है क्योंकि यह यंत्रवत् मजबूत और कार्बनिक सॉल्वैंट्स7,8केउच्च सांद्रता के लिए प्रतिरोधी है , स्थिर के एंजाइमी पाचन की अनुमति 80% ऐसीटोनीट्रिल9की उपस्थिति में प्रोटीन | इसके अलावा, एक झिल्ली पर स्थिरीकरण लक्ष्य प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तन पैदा कर सकता है, जिससे ट्रिप् टिक पाचन दक्षता10में सुधार होता है। तदनुसार, इस लेख में, हमने एक ऑन-मेम्ब्रेन पाचन तकनीक का उपयोग करके प्रोटीन इंटरैक्शन के इम्यूनोप्रीफिएशन-एलसी/एमएस/एमएस विश्लेषण के उपयोग का वर्णन किया है। यह सरल विधि भी गैर-विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के सुविधाजनक विश्लेषण की सुविधा.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने पहले एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके एपोलिपोप्रोटीन बी-100 के ऑक्सीकरणात्मक संशोधनों का विश्लेषण किया है। वर्तमान अध्ययन में, हम प्रतिरक्षा वर्षा के साथ इस तकनीक को संयुक्त और कई calpain-6 संबद्ध ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के भाग में जापान सोसायटी द्वारा विज्ञान के संवर्धन के लिए समर्थित किया गया था KAKENHI अनुदान संख्या 17K09869 (AM करने के लिए), जापान सोसायटी विज्ञान के संवर्धन के लिए KAKENHI अनुदान संख्या 15K09418 (टीएम करने के लिए), Kanehara Ichiro चिकित्सा विज्ञान फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान और Suzuken मेमोरियल फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान (सभी TM के लिए).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
Referências
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