成人ゼブラフィッシュハートの研究のための胸腔内圧注射

胸腔内圧 (それ) 注射後、外因性溶液の効果を分析することができる。この目的のために、以前に公開されたプロトコル32、33によると、魚を安楽死させるべきであり、心は、収集し、固定し、組織的に処理しました。 その方法を検証するために、まず色と蛍光染料を注入して2回の試験実験を行った。最初に、我々は、胸部の中に、魚を注入した3μ l のインクを安楽死させる。5分後に心臓を採取し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄し、2% ホルマリンで固定し、PBS で洗浄し、顕微鏡下で撮影した。第2に、インビボで1μ g/mL 4 ′、6-diamidino-2-フェニル (DAPI) の3μ l を注入し、2時間後に心臓を固定した。両方のアッセイにおいて、全マウント分析では、心室、心房および bulbus 管を含む心臓全体の標識を明らかにした (図 2a、B)。これらの結果は、注入された溶液を心臓表面に効率的に拡散することを明らかにする。 成体魚への外因性物質の送達のための一般的なプロトコルは、腹腔内 (IP) 注射である。それと心臓研究のための IP 注射の適合性を比較するために、, 我々は両方の方法を使用して DAPI の同様の量を注入し、5分と120分後に心を固定しました (図 3a).心臓を切片にし、ファロイジンのアレクサ Fluor (AF) 568 で染色し、心筋の F-アクチンにラベルを付ける。両方の時点で IP 注入後に DAPI 陽性細胞は心臓に認められなかった (図 3b)。これに対して、注入は、心筋に DAPI 標識核の存在をもたらした (図 3b)。これらの結果は、IP 注入と比較して、それが心臓への化合物の送達を改善したことを示す。 心臓再生研究のためにこの方法の適合性を試験するために、我々は、心室8を cryoinjured し、それにより、3および7日後に cryoinjury (dpci) で1μ g/ml DAPI と1μ g/ML ファロイジン AF649 の注射を行った (図 4a)。1時間後注射で、心臓を採取し、固定し、切片にし、ファロイジン AF568 で染色して、無傷の心筋を視覚化した。我々は、心筋および損傷組織の両方が多数の DAPI 陽性細胞を含んでいることを見出し、この染料を無傷の心臓および線維化組織への効率的な浸透を示す (図 4b)。さらに、注入されたファロイジン AF649 もまた、損傷領域の心筋細胞と、傷ついた区域のいくつかの募集した線維芽細胞によって組み入れられる。この実験は、薬物が心外膜を通過して、根底にある心筋に浸透できることを明らかにしている。 染料を用いた注射の効率を試験した後、心臓に注入されたタンパク質の効果を分析した。我々は、開胸24の後にアップレギュレーションされる CNTF と呼ばれるサイトカインを synthetized した。我々は、様々なプロセスにおける外因性 CNTF の効果を調べた, すなわち心筋細胞の増殖, セル外マトリックス沈着, 免疫細胞の動員と心臓保護遺伝子発現.我々は、コントロール免疫グロブリン (図 5)24と比較して、これらすべての生物学的側面が CNTF の IT 注入によって活性化されたことを発見した。これらの結果は、胸腔内圧注射の方法がタンパク質の標的送達に対して適切な戦略を提供し、種々のアッセイにおける特徴的な心臓組織への影響を研究することを示す。 図 1: 成人ゼブラフィッシュに Intrathorascic (IT) インジェクション。(A) フィラメント (6 “、1.0 mm 径) を有するプルされたマイクロインジェクション毛細管の写真と、使用する針の引き手プログラムの値。(B) フィラメント (6 “, 1.0 mm 径) を有する注入されたマイクロインジェクション毛細管の写真を 10% フェノールレッドを含む溶液の2.5 μ l を充填した。針の引っ張られた先端は最大限に7つの mm の長さである。(C) IT 注入手順の概略表現。(D) IT 注入手順の写真。この図は、備瀬 et al.24から修正されている。パネル C および D の数字は、手順の同じステップに対応する: (1) 魚を加湿されたスポンジの上に腹部側に置かれる。穿刺部位 (三角形の赤い点) は、鰓付近の胸部の中央に位置する。(2) 心膜への針の浸透。赤い点は穿刺部位を示す。(3) 注射は、心膜腔内の赤色溶液の広がりを観察することによってモニターされる。(E) IT 注入のスキーム。注入毛細管と体軸の間の角度は、心臓穿刺を避けるために30°と45°の間でなければなりません。(F) 示された容積のそれの注入の後の1時間の魚の胸郭の写真。白い矢は redish 組織を指しており、これは内部出血を示すことがある。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2: それは、心臓表面にほぼ均一に広がる溶液を注入した。(A) 2.5 μ l HBSS または2.5 μ l のインクで死後の IT 注入に供した魚の心臓全体の実体顕微鏡画像。前記心室 (V) の表面に染色されたインク、心房 (A) および bulbus 管 (Ba)。スケールバー = 300 μ m。 (B) 明るい視野と蛍光実体顕微鏡を施した魚類の全心の画像を HBSS で注入し、1μ g/mL DAPI の3μ l を用いた。DAPI は、注射後すぐに心臓部に蛍光を検出する。スケールバー = 300 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 3: 心臓に DAPI を送達するための2つの注入方法の比較。(A) 実験計画のスキーム。腹腔内 (IP) および Intrathorascic (それ) 注射は、同量の1μ g/mL DAPI (3 μ l) を用いて行った。心臓は注射後5および120分で収集された。(B) 筋線維を豊富に標識する蛍光ファロイジン (赤色) で染色された心臓切片の共焦点顕微鏡画像。DAPI を注入し、緑色で示された適切なチャネルで可視化した。IP 注入の後、DAPI は心臓において任意の時点で検出されない。それが注入された後、DAPI 陽性細胞が両時間点後に心室に存在する。スケールバー = 500 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 4: 心臓再生を研究するための注射。(A) 実験計画のスキーム。Cryoinjury の3と7日後に、DAPI とファロイジン AF649 の混合物を注入した (1 μ g/mL の3μ l)。心臓は、注射後1時間、固定、切片、ファロイジン AF568 (赤) で染色された。(B) 3 および 7 dpci における縦方向の心臓切片の共焦点顕微鏡画像。損傷した領域 (白色の破線で区切られた) とその無傷の心筋 (赤色染色) のラベルセルに DAPI (緑) およびファロイジン AF649 (青色) の標識細胞を注入した。白色矢印は、無傷のコンパクトおよび trabeculated myocardia および心外膜を介して DAPI (緑色) 分布を指している。スケールバー = 500 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 5: 外因性のそれによって注入された CNTF は、心臓のいくつかの生物学的プロセスを刺激する。(A) 実験計画のスキーム。まず、250 CNTF のゼブラフィッシュまたはコントロール免疫グロブリン (hIgG) を含む溶液の2.5 μ l を、心筋細胞において核 DsRed2 を発現するトランスジェニック魚の心膜に注射した。心臓は、注射後7および1日目 (dpi) で収集され、免疫蛍光および in situ ハイブリダイゼーションによってそれぞれ分析した。(B 次元)コントロールの心室セクションの共焦点顕微鏡観察画像と CNTF を注入した心臓。(B) 細胞周期マーカーに対する免疫染色は、minichromosome 維持複合成分 5 (MCM5; 緑) において、外因性 CNTF に応答してより多くの増殖する心筋細胞を明らかにする。スケールバー = 500 μ m。 (C) コラーゲン xii に対する免疫染色は、CNTF 注射後の心筋におけるコラーゲン xii の沈着増加を示す。制御心臓では、コラーゲン XII は心外膜34に限定される。スケールバー = 500 μ m。 (D) 免疫細胞マーカーに対する抗免疫染色は、L-PLASTIN、CNTF 注入魚における免疫細胞の増強された動員を検出する。スケールバー = 500 μ m。 (E) シスタチンに対するアンチセンス mRNA プローブを用いた in situ ハイブリダイゼーション後の心室断面の明視野顕微鏡像、心臓保護因子、心臓におけるこの遺伝子の転写アップレギュレーションを表示するCNTF の魚を注入した。スケールバー = 500 μ mこの図は、備瀬 et al.24から修正されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。