Individuazione di prodotti naturali con filtraggio della frammentazione diagnostica LC-MS/MS: applicazione per l'analisi microcystin

La spettrometria di massa tandem (MS/MS) è un metodo di spettrometria di massa ampiamente utilizzato che comporta l’isolamento di uno ione precursore e l’induzione della frammentazione tramite l’applicazione di energia di attivazione come la dissociazione indotta da collisione (CID)¹. Il modo in cui un frammento di ioni è intimamente legato alla sua struttura molecolare. I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili piuttosto che come un unico chimico unico². In quanto tali, i composti strutturalmente correlati che fanno parte della stessa classe biosintetica condividono spesso caratteristiche chiave di frammentazione MS/MS, tra cui ioni di prodotti condivisi e/o perdite neutre. La capacità di schermo campioni complessi per composti che possiedono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre è una potente strategia per rilevare intere classi di composti, potenzialmente portando alla scoperta di nuovi prodotti naturali^{3, 4 , 5} il ^{, 6}. per decenni, metodi di spettrometria di massa come la scansione di perdita neutra e la scansione di ioni precursori eseguite su strumenti a bassa risoluzione hanno consentito agli ioni con la stessa perdita neutra o gli ioni di prodotto da rilevare. Tuttavia, gli ioni o le transizioni specifiche dovevano essere definite prima di eseguire gli esperimenti. Poiché gli spettrometri di massa ad alta risoluzione sono diventati più popolari nei laboratori di ricerca, i campioni complessi sono ora comunemente sottoposti a screening utilizzando metodi di acquisizione dipendenti dai dati non mirati (DDA). Contrariamente alla tradizionale perdita neutra e alla scansione a ioni precursori, i composti strutturalmente correlati possono essere identificati mediante l’analisi post-acquisizione⁷. In questo lavoro, si dimostra una strategia che abbiamo sviluppato definito filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF)^5,6, un approccio semplice e facile da usare per rilevare intere classi di composti all’interno di matrici complesse. Questo modulo DFF è stato implementato nella piattaforma open-source MZmine 2 e disponibile scaricando MZmine 2,38 o versioni più recenti. DFF consente agli utenti di seriare in modo efficiente i DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotto e/o perdite neutre (es) che sono diagnostiche per intere classi di composti. Una limitazione della DFF è la caratteristica degli ioni di prodotto e/o le perdite neutre per una classe di composti devono essere definite dall’analista.

Ad esempio, ognuna delle più di 60 diverse micotossine fumonisine identificate^8,9 possiedono una catena laterale tricarballilico, che genera una m/z 157,0142 (C₆H₅O₅^–) prodotto ione su frammentazione della [M-H]^– Ion⁴. Pertanto, tutte le fumonisine putativo in un campione possono essere rilevate utilizzando DFF mediante lo screening di tutti gli spettri MS/MS all’interno di un DataSet DDA che contengono lo ione di prodotto m/z 157,0142 prominente. Analogamente, i composti Solfatati possono essere rilevati mediante screening dei DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono una perdita diagnostica neutra di 79,9574 da (SO₃)³. Questo approccio è stato anche applicato con successo per la rilevazione di nuovi peptidi ciclici⁵ e prodotti naturali che contengono i residui di triptofano o fenilalanina⁶.

Per dimostrare l’efficacia del DFF e la sua facilità d’uso all’interno della piattaforma MZmine¹⁰, abbiamo applicato questo approccio all’analisi delle microcistine (MCS); una classe di oltre 240 tossine strutturalmente correlate prodotte da acqua dolce cianobatteri^11,12,13.

Le cianotossine più comunemente segnalate sono MCs, con il congenitore MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) più frequentemente studiato (Figura 1). Gli MCs sono heptapeptides monociclici non ribosomiali, biosintetizzati da diversi generi di cianobatteri tra cui Microcystis, Anabaena, Nostoc e Planktothrix^12,13. Gli MCs sono composti da cinque residui comuni e due posizioni variabili occupate da aminoacidi L. Quasi tutti i MCs possiedono un residuo di acido β-aminoacido 3-ammino-9-metossi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-dienoico (Adda) alla posizione 5¹¹.  I percorsi di frammentazione MS/MS di MCS sono ben descritti^14,15; il residuo di Adda è responsabile della prominente ione MS/MS, m/z 135,0803⁺ (c₉h₁₁O⁺) e di altri ioni di prodotto tra cui m/z 163,1114⁺ (c₁₁h₁₅ O⁺) (Figura 2). I DataSet DDA non mirati degli estratti cellulari Microcystis aeruginosa possono essere proiettati per tutte le microcistine presenti utilizzando questi ioni diagnostici, dato che le microcistine hanno un residuo di Adda.