Количественная флуоресценция в ситу Гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (ИФ) специфических генных продуктов в KSHV-зараженных клетках
Summary
Мы описываем протокол с использованием флуоресценции на месте гибридизации (FISH) для визуализации нескольких герпесвиральных РНК в литически инфицированных человеческих клеток, либо в подвеске или приверженцев. Этот протокол включает в себя количественную оценку флуоресценции, производящей нуклеоцитоплазмическое соотношение и может быть расширен для одновременной визуализации принимающих и вирусных белков с иммунофлуоресценцией (ИФ).
Abstract
Механистический анализ приходит из тщательного изучения и количественной оценки конкретных РНК и белков. Относительное расположение этих биомолекул по всей клетке в определенное время может быть захвачено с флуоресценцией на месте гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (IF). Во время литической герпесвирусной инфекции вирус захватывает клетку-хозяина, чтобы преимущественно выражать вирусные гены, вызывая изменения в морфологии клеток и поведении биомолекул. Литические деятельности сосредоточены на ядерных заводах, называется вирусных репликации отсеков, которые заметны только с FISH и IF. Здесь мы описываем адаптируемый протокол РНК FISH и IF методы для Саркомы Апоши связанных герпесвирус (KSHV) инфицированных клеток, как приверженцев и в подвеске. Метод включает в себя шаги по разработке специфических антисмысловых олигонуклеотидов, двойной РНК FISH, РНК FISH с IF, а также количественные расчеты интенсивности флуоресценции. Этот протокол был успешно применен к нескольким типам клеток, неинфицированных клеток, скрытых клеток, литических клеток, временных курсов и клеток, обработанных ингибиторами для анализа пространственно-временной деятельности конкретных РНК и белков как от хозяина человека, так и КШВ.
Introduction
В их литической (активной) фазе, герпесвирусы захватывают клетку-хозяина, вызывая изменения в морфологии клеток и локализации биологических молекул, для производства вирионов. Основой операций является ядро, где двухцепочечный геном ДНК вирусного реплицируется и упакован в белковую оболочку, называемую капсидом1. Для начала вирус выражает свои собственные белки, угон принимающей машины и предотвращения экспрессии несущественных генов хозяина, процесс, называемый эффект выключения хозяина. Большая часть этой деятельности локализована на конкретные 4 “,6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) свободных ядерных регионов, называемых вирусных репликации отсеков, состоящий из как принимающих и вирусных белков, РНК, и вирусной ДНК2. Ячейка капитально отремонтирована, чтобы обеспечить пространство и ресурсы для репликации отсеков и, таким образом, сборки вирусных капсидов. После того, как капсид выходит из ядра, как капсид окутан цитоплазмой для производства мембраны связанных вирусной частицы, также известный как вирион, неясно. Понимание локализации и пространственных сдвигов как хоста, так и вирусных биомолекул во время литической фазы обеспечивает более глубокое механистическое понимание расположения отсека репликации, эффекта выключения хозяина, пути выхода из virиона и других процессов, связанных с герпесвирусной инфекцией и репликацией.
В настоящее время лучшим методом обнаружения и изучения этих изменений является визуализация белков и РНК в инфицированных клетках с иммунофлуоресценцией (ИФ) и флуоресцентной гибридизации на месте (FISH), соответственно. Использование временного курса с помощью этих методов показывает локализацию биомолекул в ключевых точках литической фазы или просто пространственно-временных данных. FISH и IF дополняют другие биохимические методы, такие как ингибирование клеточного процесса (например, ингибирование репликации вирусной ДНК), RT-qPCR (цепная реакция полимеразы в реальном времени), секвенирование РНК, северные помарки, масс-спектрометрия, западная блоттинг и анализ производства вирусной ДНК, который может обеспечить более глобальную картину клеточной деятельности.
Мы разработали стратегии RNA FISH для изучения продуктов РНК из конкретных генов и вычислительного анализа, который количественно вычисляет нуклеоцитоплазмическое соотношение конкретного генного продукта. Подготовка образца, измененная из предыдущих публикаций Steitz и коллегами3,4,относительно проста и может быть использована как для приверженцев, так и для подвесных клеток. Протокол также адаптируется для одновременного использования нескольких стратегий РНК FISH (двойная РНК FISH) или RNA FISH со стратегиями IF. Разработка конкретной стратегии FISH является сложной задачей, но предложения по улучшению успеха изложены. Анализ данных, описанный здесь, является количественным, если используются флуоресцентные бусы и сильные маркеры границ отсека, и дает дополнительное представление о микрографах, понимание, которое устраняет предвзятость наблюдения. Подробный протокол предназначен как для скрытых, так и для литических клеток, инфицированных саркома-ассоциированным герпесвирусом Капоши (KSHV) и может быть использован с неинфицированными клетками или клетками, инфицированными другими герпесвирусами5. Методы количественной оценки применимы к исследованиям по нуклеоцитоплазматическим сдвигам или перелокализации между субклеточными отсеками в большинстве клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в настоящем докладе, может быть адаптирован к различным типам клеток и включает в себя шаги для двойной РНК FISH и RNA FISH с IF с использованием как моноклональных, так и поликлональных первичных антител. Хотя подготовленные слайды, как правило, изображены с конфокальный м…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джонатана Роденфельса, Казимира Тычовски и Джоанну Б. Уизерс за советы по анализу данных. Мы также благодарим Г. Хейворд за анти-SSB антитела. Эта работа была поддержана грантами T32GM007223 и T32AI055403 от Национальных институтов здравоохранения (для ТКВ) и грантом NIH (CA16038) (для JAS). JAS является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза. Цифры 1-3 и таблица 1 были воспроизведены с разрешения Американского общества микробиологии под лицензией Creative Commons Attribution из следующей публикации: Валлери, Т. К., Уизерс, Дж.Б., Андо, Дж.А., Штейтц, Саркома-Ассоциированные Дж.А. Капоши Накопление герпесвируса мРНК в ядерной foci зависит от вирусной репликации ДНК и вирусного некодирования полиаденинатной ядерной РНК. В журнале вирусологии. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
Referências
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
