Summary

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Published: August 27, 2019
doi:

Summary

Descriviamo un protocollo che utilizza la fluorescenza nell’ibridazione situ (FISH) per visualizzare più RNA herpesvirali all’interno di cellule umane lytically infette, sia in sospensione che aderenti. Questo protocollo include la quantificazione della fluorescenza producendo un rapporto nucleocitoplasmatica e può essere esteso per la visualizzazione simultanea di proteine ospite e virali con immunofluorescenza (IF).

Abstract

Le informazioni meccanicistiche arrivano da un attento studio e quantificazione di RNA e proteine specifici. Le posizioni relative di queste biomolecole in tutta la cellula in momenti specifici possono essere catturate con la fluorescenza nell’ibridazione situ (FISH) e l’immunofluorescenza (IF). Durante l’infezione da herpesvirus littico, il virus dirotta la cellula ospite per esprimere preferibilmente geni virali, causando cambiamenti nella morfologia cellulare e nel comportamento delle biomolecole. Le attività littiche sono incentrate in fabbriche nucleari, definite compartimenti di replicazione virale, che sono distinguibili solo con FISH e IF. Qui descriviamo un protocollo adattabile delle tecniche RNA FISH e IF per le cellule infettate associate al sarcoma (KSHV) di Kaposi, sia aderenti che in sospensione. Il metodo include passaggi per lo sviluppo di specifici oligonucleotidi anti-senso, doppio RNA FISH, RNA FISH con IF, e calcoli quantitativi di intensità di fluorescenza. Questo protocollo è stato applicato con successo a più tipi di cellule, cellule non infette, cellule latenti, cellule littiche, corsi temporali e cellule trattate con inibitori per analizzare le attività spatiotemporali di RNA specifici e proteine sia dall’ospite umano che il kSHV.

Introduction

Nella loro fase litetica (attiva), gli herpesvirus dirottano la cellula ospite, causando cambiamenti nella morfologia cellulare e nella localizzazione delle molecole biologiche, per produrre virioni. La base delle operazioni è il nucleo, dove il genoma virale del DNA a doppio filamento viene replicato e confezionato in un guscio proteico, chiamato capside1. Per cominciare, il virus esprime le proprie proteine, dirottando i macchinari ospiti e impedendo l’espressione di geni ospiti non essenziali, un processo chiamato effetto di chiusura dell’ospite. La maggior parte di questa attività è localizzata in specifiche regioni nucleari prive di 4,6-diamidino_2 -fenylindole (DAPI) chiamate compartimenti di replicazione virale, composti da proteine host e virali, RNA e DNA virale2. La cella viene revisionata per fornire spazio e risorse per i compartimenti di replicazione e quindi l’assemblaggio di capsidi virali. Una volta che il capside esce dal nucleo, non è chiaro come il capside sia avvolto nel citoplasma per produrre una particella virale legata alla membrana, nota anche come virione. La comprensione della localizzazione e degli spostamenti spaziali delle biomolecole sia dell’ospite che di quella virale durante la fase littica fornisce una visione più profonda meccanistica della disposizione del compartimento di replicazione, dell’effetto di spegnimento dell’ospite, della via virione-uscita e di altri processi correlati all’infezione da herpesviral e alla replicazione.

Attualmente il metodo migliore per rilevare e studiare questi cambiamenti è la visualizzazione di proteine e RNA nelle cellule infette con immunofluorescenza (IF) e l’ibridazione fluorescente in situ (FISH), rispettivamente. L’uso di un corso temporale con queste tecniche rivela la localizzazione delle biomolecole nei punti chiave della fase littica o semplicemente, dati spatiotemporali. FISH e IF completano altre tecniche biochimiche, come l’inibizione di un processo cellulare (ad esempio, l’inibizione della replicazione del DNA virale), RT-qPCR (reazione a catena polimerasi in tempo reale), il sequenziamento dell’RNA, le macchie settentrionali, la spettrometria di massa, l’oscillazione occidentale e l’analisi della produzione di DNA virale, che può fornire un quadro più globale delle attività cellulari.

Abbiamo sviluppato strategie di RNA FISH per esaminare i prodotti dell’RNA da geni specifici e un’analisi computazionale che calcola quantitativamente il rapporto nucleocitoplasmatico di un prodotto genetico specifico. La preparazione di esempio, modificata da pubblicazioni precedenti da Steitz e colleghi3,4, è relativamente semplice e può essere utilizzata sia per le cellule aderenti che per le cellule sospese. Il protocollo è anche adattabile per l’uso simultaneo di più strategie DI RNA FISH (double RNA FISH) o RNA FISH con strategie IF. Lo sviluppo di una strategia FISH specifica è impegnativo, ma vengono delineati suggerimenti per migliorare il successo. L’analisi dei dati qui descritta è quantitativa se vengono utilizzate perline fluorescenti e forti indicatori di confini di compartimenti e offre ulteriori informazioni sulle micrografie, informazioni che eliminano la distorsione di osservazione. Il protocollo dettagliato è progettato per cellule latenti e litine infettate dall’herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) e può essere utilizzato con cellule non infette o cellule infettate da altri herpesvirus5. I metodi di quantitazione sono applicabili agli studi sui spostamenti nucleocitoplasmatici o sulla rilocalizzazione tra compartimenti subcellulari nella maggior parte delle cellule.

Protocol

1. Progettazione di oligonucleotidi antisenso a fluorescenza in situ (FISH) per rilevare una specifica trascrizione dell’herpesvirale Selezionare da 25 a 40 nt segmenti dalla sequenza di RNA di interesse e convertire in modo anti-senso. Una strategia FISH di successo può contenere da uno fino a dieci o più oligonucleotidi anti-senso diversi. Quando si selezionano le sequenze, tenere presente quanto segue: Se l’RNA di interesse contiene una regione di ripetizione unica, sfrutta questa funzione e proget…

Representative Results

I metodi FISH e IF descritti in questo manoscritto sono illustrati nella Figura 1 insieme alla quantificazione dei risultati per traccia di linea di intensità fluorescente. I risultati qui presentati sono semi-quantitativi e offrono una visione della localizzazione, piuttosto che nel confronto tra intensità di diverse macchie fluorescenti perché gli esperimenti non includevano una perla fluorescente nella preparazione del vetrino. La f…

Discussion

Il protocollo descritto in questo rapporto può essere adattato a diversi tipi di cellule e include passi per raddoppiaRE RNA FISH e RNA FISH con IF utilizzando anticorpi primari monoclonali e policlonali. Anche se i vetrini preparati sono tipicamente immagini con un microscopio confocale, l’imaging può essere eseguito con un microscopio STED (esaurimento delle emissioni stimolato) dopo le modifiche di una maggiore concentrazione di anticorpi e di un diverso mezzo di montaggio. Per un’analisi avanzata delle singole cell…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski e Johanna B. Withers per consigli sull’analisi dei dati. Ringraziamo anche G. Hayward per l’anticorpo anti-SSB. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni T32GM007223 e T32AI055403 dai National Institutes of Health (a TKV) e niH grant (CA16038) (a JAS). JAS è un investigatore dell’Howard Hughes Medical Institute. Le figure 1-3 e 1 tabella sono state riprodotte con il permesso dell’American Society for Microbiology sotto una licenza di attribuzione Creative Commons della seguente pubblicazione: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, Sarcoma-Associated di J. A. Kaposi L’accumulo di mRNA da herpesvirus nei foci nucleari è influenzato dalla replicazione del DNA virale e dall’RNA nucleare policodificato virale non codificante. Giornale di Virologia. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

Materials

AlexaFluor594-5-dUTP Life Technologies C1100
anti-DIG FITC  Jackson Lab Immunologicals 200-092-156
Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody Invitrogen A-11037 Goat
Anti-SSB Antibody N/A N/A Ref. Chiou et al. 2002
BLASTn NIH NCBI N/A Free Sequence Alignment Software
Dextran Sulfate Sigma Aldrich D8906 Molecular Biology Grade
DIG-Oligonucleotide Tailing Kit Sigma Roche #03353583910 2nd Gen
Eight-Chamber Slides Nunc Lab Tek II #154453 Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. 
Formamide Sigma Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
GAPDH Probes Stellaris SMF-2019-1 Compatible with protocol, Quasar 670
ImageJ  NIH, Bethesda, MD N/A Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzer IDT N/A Free Oligonucleotide Analyzer 
pcDNA3 Invitrogen A-150228
pmaxGFP Amaxa VDF-1012
Poly L-Lysine Sigma Aldrich P8920
Terminal Transferase Sigma Roche #003333574001
Vanadyl Ribonucleoside Complexes  NEB S1402S
Vectashield Vector Laboratories, Inc.  H-1000 DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. 

Referências

  1. Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  3. Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
  4. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
  5. Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
  6. Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  9. Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
  10. Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
  11. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  12. Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
  13. Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
  14. Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
  15. Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
  16. Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
  17. Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
  18. Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).

Play Video

Citar este artigo
Vallery, T. K., Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (150), e59697, doi:10.3791/59697 (2019).

View Video