Wide-felt enkelt-photon optisk optagelse i hjernen skiver ved hjælp af spændings følsom Dye

Wide-felt enkelt photon spændings følsom farvestof (VSD) Imaging af bulk-farvede hjernen skive præparater er blevet et nyttigt kvantitativt redskab til at vurdere dynamikken i neurale kredsløb^1,2,3,4 . Efter analysen af ændringerne i optiske egenskaber på grund af membran excitation^5,6,7, VSD Imaging blev først beskrevet i begyndelsen af 1970 ‘ erne af Cohen og andre^{6,8, 9}.; Det er en passende metode til at overvåge hjernens funktioner i realtid, da farvestoffet direkte sonerer membranens potentielle ændringer (dvs. det primære signal fra neuronerne).

De tidligste Vsd’er besad de ønskværdige egenskaber til at forstå hjernen systemet, såsom en hurtig tid-konstant til at følge den hurtige kinetik af neuronal membran potentielle hændelser, og linearitet med ændringen i membran potentiale^{9, 10} stk. ^{, 11} af ^{, 12} ud af ^{, 13} ud af ^{, 14} ud af ^{, 15}. svarende til andre Imaging eksperimenter, denne teknik kræver en bred vifte af specifikke tunings, såsom kameraer, optik, software, og skive fysiologi, for at opnå de ønskede resultater. På grund af disse tekniske faldgruber, de forventede fordele under den indledende indsats ikke nødvendigvis materialiserer for de fleste af de laboratorier, der ikke specialiserer sig i denne teknik.

Den primale årsag til de tekniske vanskeligheder var den lave følsomhed af VSD mod membranen potentiel ændring, når den anvendes til bulk farvning af skive præparater. Størrelsen af det optiske signal (dvs. fraktioneret ændring i fluorescens) er normalt 10^-4-10^-3 af kontrol (F0) signal under fysiologiske forhold. Tidsskalaen for membran potentiel ændring i en neuron er ca. millisekunder til få hundreder af millisekunder. For at måle ændringer i membran potentialet af Neuron, skal kameraet, der anvendes til optagelsen være i stand til at erhverve billeder med høj hastighed (10 kHz til 100 Hz). Den lave følsomhed af VSD og den hastighed, der kræves for at følge det neurale signal kræver en stor mængde lys, der skal indsamles på kameraet ved en høj hastighed, med et højt signal-støj-forhold (S/N)^2,16.

Den optik af optagelsen systemet er også et afgørende element for at sikre indsamling af tilstrækkelig lys og til at forbedre S/N. Den forstørrelse opnået ved optikken er ofte alt for lav, såsom 1X til 10X, at visualisere en lokal funktionel neurale kredsløb. For eksempel, at visualisere dynamikken i hippocampus kredsløb, en forstørrelse på ca. 5 ville være egnet. En sådan lav forstørrelse har lav fluorescens effektivitet; Derfor ville avanceret optik være gavnlig for en sådan optagelse.

Desuden er Skive fysiologi også afgørende. Da billedbehandlings analysen kræver, at skiverne skal være intakte, er det nødvendigt med omhyggelig skive håndtering¹⁷. Desuden er de foranstaltninger, der er truffet for at opretholde udsnittets levedygtighed i længere tid, vigtige¹⁸.

Den nuværende artikel beskriver protokollen til forberedelse af skiver, VSD farvning, og målinger. Artiklen skitserer også forbedringerne til Vsd’er, billedenhed, og optik, og andre yderligere raffinementer til det eksperimentelle system, der har aktiveret denne metode, der skal anvendes som en ligetil, kraftfuld, og kvantitativ analyse til visualisering af ændring af hjernens funktioner^{19,20,21,22,23,24,25}. Teknikken kan også anvendes i vid udstrækning til langsigtede potensering i¹-området af hippocampale skiver 1. Desuden er denne teknik også nyttig i optisk optagelse af membran potentialer i en enkelt nerve celle²⁶.