Vi introducerer en reproducerbar og stabil optisk optagelsesmetode til hjerne skiver ved hjælp af spændings følsom farve. Artiklen beskriver spændings følsom farvning af farvestoffer og registrering af optiske signaler ved hjælp af konventionelle hippocampale skive præparater.
Wide-felt enkelt photon spændings følsomt farvestof (VSD) billeddannelse af hjernen skive præparater er et nyttigt redskab til at vurdere den funktionelle konnektivitet i neurale kredsløb. På grund af den fraktioneret ændring i lys signalet, har det været vanskeligt at bruge denne metode som en kvantitativ analyse. Denne artikel beskriver specielle optik-og skive håndteringssystemer, som gør denne teknik stabil og pålidelig. Den nuværende artikel demonstrerer udsnittet håndtering, farvning, og optagelse af VSD-farvede hippocampus skiver i detaljer. Systemet opretholder fysiologiske forhold i lang tid, med god farvning, og forhindrer mekaniske bevægelser af udsnittet under optagelserne. Desuden gør det muligt farvning af skiver med en lille mængde af farvestoffet. Optikken opnår høj numerisk blænde ved lav forstørrelse, hvilket gør det muligt at optage VSD-signalet ved den maksimale billedhastighed på 10 kHz, med 100 pixel x 100-pixel rumlig opløsning. På grund af den høje billedhastighed og rumlige opløsning, tillader denne teknik anvendelse af efter optagelses filtre, der giver et tilstrækkeligt signal-støjforhold til at vurdere ændringerne i neurale kredsløb.
Wide-felt enkelt photon spændings følsom farvestof (VSD) Imaging af bulk-farvede hjernen skive præparater er blevet et nyttigt kvantitativt redskab til at vurdere dynamikken i neurale kredsløb1,2,3,4 . Efter analysen af ændringerne i optiske egenskaber på grund af membran excitation5,6,7, VSD Imaging blev først beskrevet i begyndelsen af 1970 ‘ erne af Cohen og andre6,8, 9.; Det er en passende metode til at overvåge hjernens funktioner i realtid, da farvestoffet direkte sonerer membranens potentielle ændringer (dvs. det primære signal fra neuronerne).
De tidligste Vsd’er besad de ønskværdige egenskaber til at forstå hjernen systemet, såsom en hurtig tid-konstant til at følge den hurtige kinetik af neuronal membran potentielle hændelser, og linearitet med ændringen i membran potentiale9, 10 stk. , 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14 ud af , 15. svarende til andre Imaging eksperimenter, denne teknik kræver en bred vifte af specifikke tunings, såsom kameraer, optik, software, og skive fysiologi, for at opnå de ønskede resultater. På grund af disse tekniske faldgruber, de forventede fordele under den indledende indsats ikke nødvendigvis materialiserer for de fleste af de laboratorier, der ikke specialiserer sig i denne teknik.
Den primale årsag til de tekniske vanskeligheder var den lave følsomhed af VSD mod membranen potentiel ændring, når den anvendes til bulk farvning af skive præparater. Størrelsen af det optiske signal (dvs. fraktioneret ændring i fluorescens) er normalt 10-4-10-3 af kontrol (F0) signal under fysiologiske forhold. Tidsskalaen for membran potentiel ændring i en neuron er ca. millisekunder til få hundreder af millisekunder. For at måle ændringer i membran potentialet af Neuron, skal kameraet, der anvendes til optagelsen være i stand til at erhverve billeder med høj hastighed (10 kHz til 100 Hz). Den lave følsomhed af VSD og den hastighed, der kræves for at følge det neurale signal kræver en stor mængde lys, der skal indsamles på kameraet ved en høj hastighed, med et højt signal-støj-forhold (S/N)2,16.
Den optik af optagelsen systemet er også et afgørende element for at sikre indsamling af tilstrækkelig lys og til at forbedre S/N. Den forstørrelse opnået ved optikken er ofte alt for lav, såsom 1X til 10X, at visualisere en lokal funktionel neurale kredsløb. For eksempel, at visualisere dynamikken i hippocampus kredsløb, en forstørrelse på ca. 5 ville være egnet. En sådan lav forstørrelse har lav fluorescens effektivitet; Derfor ville avanceret optik være gavnlig for en sådan optagelse.
Desuden er Skive fysiologi også afgørende. Da billedbehandlings analysen kræver, at skiverne skal være intakte, er det nødvendigt med omhyggelig skive håndtering17. Desuden er de foranstaltninger, der er truffet for at opretholde udsnittets levedygtighed i længere tid, vigtige18.
Den nuværende artikel beskriver protokollen til forberedelse af skiver, VSD farvning, og målinger. Artiklen skitserer også forbedringerne til Vsd’er, billedenhed, og optik, og andre yderligere raffinementer til det eksperimentelle system, der har aktiveret denne metode, der skal anvendes som en ligetil, kraftfuld, og kvantitativ analyse til visualisering af ændring af hjernens funktioner19,20,21,22,23,24,25. Teknikken kan også anvendes i vid udstrækning til langsigtede potensering i1-området af hippocampale skiver 1. Desuden er denne teknik også nyttig i optisk optagelse af membran potentialer i en enkelt nerve celle26.
Udsnittet fysiologi er afgørende for at indsamle det rigtige signal. Brugen af ring membranfilter systemet i denne protokol sikrer, at udsnittet forbliver sundt og un-forvrænget under hele proceduren2,16,17. Andre systemer kan bruges til at bevare skive fysiologi under optagelsen, men udsnittet bør ikke blive deformeret på noget tidspunkt, da billeddiagnostik behøver alle dele af udsnittet for at være sundt. Ring-membranfi…
The authors have nothing to disclose.
TT modtog JSPS KAKENHI-tilskuddet (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 og JP15K00413) fra MEXT og tilskud fra ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] og H30 [18062156]). Vi vil gerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk sprog redigering.
High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |