JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Высокопроходимый анализ оптических картографических данных с помощью ElectroMap

Published: June 04, 2019
doi:
10.3791/59663
, , , , , , , , , , , ,
1Institute of Cardiovascular Sciences,University of Birmingham, 2EPSRC Centre for Doctoral Training in Physical Sciences for Health, School of Chemistry,University of Birmingham, 3School of Computer Science,University of Birmingham, 4Institute of Clinical Sciences,University of Birmingham, 5Institute of Microbiology and Infection, School of Biosciences,University of Birmingham

Summary

Этот протокол описывает настройку и использование ElectroMap, программной платформы с открытым исходным кодом MATLAB для анализа сердечных оптических картографических данных. ElectroMap предоставляет универсальный инструмент высокой пропускной связи для анализа оптического картографического напряжения и наборов данных кальция по широкому кругу экспериментальных моделей сердечного содействия.

Abstract

Оптическое картирование является устоявшейся методикой для исследования высокого пространственно-временного разрешения сердечной электрофизиологии в многоклеточных препаратах. Здесь мы представляем, в шагзая направляясь, использование ElectroMap для анализа, количественной оценки и картирования высокого разрешения напряжения и наборов данных кальция, приобретенных оптическим картографией. Варианты анализа ElectroMap охватывают широкий спектр ключевых электрофизиологических параметров, а графический пользовательский интерфейс позволяет просто модифицировать определения предварительной обработки и параметров, что делает ElectroMap применимым к широкому кругу экспериментальных моделей. Мы показываем, как встроенный процесс определения частоты и сегментации сигнала позволяет высокой пропускной способности анализа всех экспериментальных записей, острых реакций, и один удар-бить изменчивости. Кроме того, ElectroMap включает в себя автоматизированную многобитную усреднение для улучшения качества сигнала шумных наборов данных, и здесь мы демонстрируем, как эта функция может помочь прояснить электрофизиологические изменения, которые в противном случае могли бы остаться незамеченными при использовании одного бить анализа. Пользовательские модули включены в программное обеспечение для детального изучения проводимости, анализа одного файла и переменных, как показано здесь. Эта программная платформа может быть использована для обеспечения и ускорения обработки, анализа и картирования сложной сердечной электрофизиологии.

Introduction

Оптическое картирование использует флуоресцентные репортеры напряжения и/или концентрации кальция для допроса сердечной электрофизиологии (EP) и обработки кальция в многоклеточных препаратах, с большим пространственным разрешением, чем достижимо с традиционными методы1,2,3. Таким образом, оптическое картирование стало важным и все более все более используемым методом, обеспечивая ключевые идеи в физиологических и патофизиологических электрического поведения в сердце3,4,5 ,6,7,8. Эффективная обработка и анализ данных, полученных в ходе экспериментов по оптическому картированию, осложняется несколькими факторами. Высокий пространственно-временное разрешение данных оптических наборов карт приводит к тому, что файлы необработанных видео, состоящие из тысяч кадров изображений, каждый из которых состоит из нескольких отдельных пикселей, приводит к большим файлам данных, которые требуют высокой пропускной записи и автоматизации обработка9. Небольшие размеры пикселей, плохая и неравномерная загрузка красителя и небольшие дробные изменения в флуоресценции приводят к оптическим сигналам с низким соотношением сигнала к шуму (SNR), требующим предварительной обработки до эффективного анализа достижимо10. Обработка и анализ могут быть дополнительно осложнены использованием оптогенетических протоколов, которые используют свет, чтобы инициировать активацию, потенциально искажая записанный сигнал от флуоресцентных датчиков11,12. Кроме того, после обработки данных для измерения параметров, представляющих интерес, можно применять несколько несогласованных методов и определений, при этом наиболее применимые методы варьируются в зависимости от экспериментальной настройки, модели и вопроса2, 10,13. Эти ограничения препятствуют дальнейшему поглощению технологии и препятствуют подлинно объективному анализу.

Чтобы преодолеть эти ограничения, несколько исследовательских групп разработали пользовательские конвейеры обработки с учетом их экспериментальной модели, вопрос и оборудование7,14,15,16. Другие используют коммерческие несвободные программы, где основные алгоритмы могут быть трудно получить доступ4,17. В результате этого существует явная потребность в свободно доступной программной платформе с открытым исходным кодом для обработки и анализа оптических картографических данных. Важно, что это программное обеспечение является открытым исходным кодом, простым в использовании, гибким к корректировке параметров, применимым к ряду экспериментальных моделей с различными свойствами EP и принципиально позволяет простой и настраиваемой количественной оценки диапазона сердечных параметры, которые могут быть изучены с помощью оптического картирования.

Недавно мы опубликовали и выпустили всеобъемлющую программную платформу, ElectroMap, для высокой по всей, полуавтоматической обработки, анализа и картирования сердечных оптических картовых наборов данных13. Здесь мы представляем видео-руководство по использованию ElectroMap и демонстрируем, как его можно использовать для обработки, анализа и картирования нескольких оптических наборов карт. Мы фокусируемся на использовании ElectroMap для количественной оценки стандартных переменных EP и кальция и демонстрируем использование автономной скорости проводимости, анализа одного файла и переменных модулей.

Protocol

1. Сбор данных оптического картографирования Выполните сердечное оптическое картирование с помощью одного изширокого спектра экспериментальных моделей, включая нетронутые и изолированные целые сердца 6,18,изолированные атриа14,19,вентрикулярные клинья20, сердечные ломтики 21 год , 22, и клеточные монослои23. Ознакомьтесь с ссылками на экспериментальные проекты для сбора необработанных оптических картографических данных этих препаратов. При условии, что полученные данные могут быть преобразованы в стек tiff или сохранены в . MAT файл, он должен быть анализируемым с помощью ElectroMap. Это включает данные различных размеров (квадрат/прямоугольный) и разрешения (максимально протестировано в настоящее время 2048 пикселей x 2048 пикселей). 2. Установка программного обеспечения и запуск ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены подробные два метода для установки и запуска ElectroMap – либо в РАМКАХ MATLAB работать из исходного кода (.м.) или в качестве автономного исполняемого файла (.exe для окон). Окончательное программное обеспечение и его функциональность являются инвариантными между двумя вариантами настройки (кроме нескольких различий в навигации каталога). Таким образом, основными соображениями при выборе версии для установки являются доступ к MATLAB и необходимые наборы инструментов и является ли доступ к исходному коду желательно. Там, где это возможно, рекомендуется использовать версию MATLAB для более быстрого времени запуска, более короткого времени обработки и упрощения сообщения об ошибках. Настройка 1: Запуск электрокарты в MATLAB Установите MATLAB. ElectroMap был разработан в MATLAB 2017a, однако, программное обеспечение было протестировано для использования во всех последующих релизах MATLAB (до 2018b на момент написания статьи). Требуются следующие наборы инструментов: обработка изображений, обработка сигналов, статистика и машинное обучение, а также установка кривой. Скачать/клонировать все файлы из последнего выпуска «исходного кода» ElectroMap из репозитория GitHub (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Распаковать загруженное содержимое в нужное место. Откройте MATLAB и перейдите к местоположению папки, где размещаются исходные коды ElectroMap. Затем откройте файл ElectroMap.m и нажмите в редакторе, или же введите ElectroMap в окне команды и нажмите RETURN. Это позволит начать пользовательский интерфейс ElectroMap, Рисунок 1A. Настройка 2: Автономный файл .exe Скачать файл установки: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI. Следуйте инструкциям в установке, которая будет загружать требуется MATLAB время выполнения из Интернета наряду с программным обеспечением ElectroMap. Выполнить ElectroMap.exe.ПРИМЕЧАНИЕ: Время запуска для автономной версии может составлять несколько минут. 3. Загрузка и предварительная обработка изображений Нажмите Select Folder и перейдите к месту анализа файла данных(ы) для анализа. Это позволит заполнить левую поле список со всеми файлами в этом каталоге, которые имеют правильный тип файла (.tif или . МАТ). . Файлы MAT должны содержать только переменную стека изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: При переходе через селектор каталога будут отображаться только папки, а не отдельные файлы. Выберите файл для загрузки из интерфейса и нажмите Нагрузочныеизображения. После загрузки появится первый кадр, а красный контур будет указывать на автоматическое замыкание изображения. При необходимости перезагрузите ранее использовавую рентабельность инвестиций, выбрав рентабельность инвестиций Save/Load. В этом случае пропустите шаг 3.3. По умолчанию пороговое значение основано на интенсивности пикселей в первом кадре. При желании измените это до порога, основанного на амплитуде курса времени сигнала, изменив опцию в меню «Изображение» для меню снижения порога. Обратите внимание, что после выбора порогового значения оно применяется для всего стека изображений. При желании измените опцию порога на ручную,которая активирует ползунок для ручной настройки порога изображения. Кроме того, изображениясельскохозяйственных культур (Crop Image) и/или нарисовать пользовательский регион интереса (CustomROI)для анализа, выбрав соответствующий тиковый ящик (es) ниже пороговых параметров. Обратите внимание, что расширенные варианты выбора региона интересов, такие как количество областей, доступны из ROI Selection из верхнего меню. После того, как соответствующий порог был применен, нажмите Процесс изображения применять обработки. Настройки для обработки приведены ниже (шаг 3.4.1-3.4.5). На этом этапе убедитесь, что правильные настройки камеры были введены. Это Pixel Size в мкм (IMPORTANT: это размер пикселей изображения, а не размер пикселей, которые составляют чип или эквивалентное оборудование в устройстве визуализации) и Framerate в кГц. Для инверсии сигнала отметьте флажок Invert Data. Если сообщается флуоресцентный сигнал обратно пропорциональн параметру интереса (как с обычно используемыми potentiometric красителями) сигнал может быть инвертирован. Для пространственной фильтрации выберите Gaussian или Average из меню ядра. Размер пространственной усредненной области контролируется вводимым вводами размера, примыкающим к меню выпадения ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра фильтра ядра ядра ядра ядра фильтра ядра ядра ядра фильтра ядра ядра ядра ядра ядра ядра фильтра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра ядра пикселя x 3 пиксель). При применении гауссианского фильтра стандартное отклонение также может быть установлено из ввода Sigma. Для коррекции базовой линии выберите Top-hat24 или полиномиальную (4-ю или 11-ю степень) коррекцию25 из базового меню. Коррекция может быть применена к каждому пикселю индивидуально (долгое время обработки) или в среднем по всему изображению (быстрее, но предполагает однородные базовые изменения). Коррекция верхней шляпы также может быть изменена, установив длину Top-Hat в миллисекундах, примыкающей к меню выпадения исходного выбора. Длина ядра Top-Hat должна быть больше, чем шкала времени индивидуальных потенциалов действия / переходных кальция. Для временной фильтрации выберите савицкий-вратарский или бесконечный импульс (IIR) фильтрации из меню фильтрации.ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением ткани усредненный сигнал, который появляется в левом нижнем углу, височная фильтрация применяется к каждому пикселю индивидуально во время количественной оценки параметров из диапазона усредненного изображения ансамбля. Это было реализовано для сокращения времени обработки путем фильтрации небольших разделов данных, когда это необходимо, а не целые файлы. Для удаления кадра обратите внимание, что при выборе опции «Удалить кадры» из набора изображений могут быть удалены большие пики с амплитудой, превышающее сигнал интереса. Это может быть полезно в оптически темп наборы данных, таких как оптогенетической ходить, где деполяризация инициируется оптической активации опсинов, таких как channelrhodopsin 211,12.ПРИМЕЧАНИЕ: Как удаление кадра потенциально ввести нефизиологические изменения шага в сигналы изображения, височная фильтрация может ввести артефакты в данные и поэтому не рекомендуется здесь. Обратите внимание, что сигнал будет сегментирован после того, как образы процесса были выбраны в соответствии с вариантами под параметры сегментации,однако это может быть быстро изменено без переработки всего набора данных (см. раздел 4). 4. Сегментация данных и усреднение ансамбля ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как файл был обработан, пики в ткани усредненный сигнал (нижний правый след, рисунок 1A) будут обнаружены и помечены красными кругами. Учитываются только пики выше установленного порога (синяя линия на следе, установленном Пиковым порогом). Кроме того, пики учитываются только в том случае, если они достаточно задерживаются по сравнению с предыдущими пиками, установленными ввозам Min Peak Distance. Сигнал затем сегментируется на основе обнаруженных пиков. Во-первых, эффективная длина цикла (CL) каждого пика рассчитывается путем измерения времени между ним и следующим пиком. Если количество пиков (установленных Min Число пиков вход) имеют аналогичные ClLs (порог, для которого устанавливается минимальная граница ввода), то они сгруппированы и средний CL для этих пиков рассчитывается. Для дальнейшей сегментации данных, нажмите Сегмент Сигнал. Варианты подсегментации: Нет – все пики с тем же CL сгруппированы вместе; Все – Сегменты nпиков в течение постоянных времен CL (nпики устанавливаются вводимым размером сегмента) идентифицируются; Последнее – Заключительные nпики до изменения CL определены и сгруппированы, а все остальные не анализируются; и Single Beat – Это эквивалентно применению Все сегментации с nпиками No 1, и поэтому никакая группировка или ансамбль в среднем (см. 4.5) не применяются. Это можно применить, выбрав кнопку Single Beat. Примените пользовательскую сегментацию сигнала путем увеличения времени интереса и выбора сигналасегмента. Это добавит дополнительную опцию, озаглавленную «Секция масштабирования», в поле списка разделов, соответствующую выбранным таймочкам. Результаты сегментации будут отображаться в списке-коробке, прилегающей к усредненному сигналу ткани, и покажут номер раздела и расчетный CL. Все сегментированные временные секции обозначаются разными цветами. Выберите сегмент из списка-бокса, чтобы выделить этот раздел красным цветом. Это также автоматически запустит анализ этого раздела, как если бы была выбрана кнопка «Карты производства» (см. раздел 5). Анализ сгруппированных пиков будет проводиться на данных об усредненных «ансамбле». Это включает в себя усреднение пиков в сегменте вместе, с точки времени отсчета пики определены в шаге 4.2. Обновление временного окна в среднем путем изменения до и после входов и нажатия сигнала сегмента. 5. Потенциал действия/анализ преходящей длительности и скорости проводимости кальция После обработки изображений кнопка Produce Maps станет активной. Пресс Продукция Карты для применения действия потенциальной продолжительности (APD), время активации, скорость проводимости и SNR анализа. По умолчанию анализ будет применяться к первому сегменту сигнала. Выберите другие сегменты из списка-коробки будет применяться анализ для выбранного сегмента.ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты анализа отображаются в таблице результатов, включая среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку, дисперсию и 5-й по 95-й процентильный анализ. Сроки карты называются “APD” карты однако, кальций сигналы обрабатываются с использованием тех же параметров будет измерять кальций переходной продолжительности. Выберите Get Pixel Info, чтобы увидеть детальное отображение сигнала из любого пикселя в изображении, и сравните пикселей одновременно с сигналами сюжета из до 6 мест. Используйте панель обработки сигналов для настройки параметров для анализа продолжительности. Эти: Продолжительность – Время реполяризации/распада для измерения от пика; Базовый униза “APD” – период времени сигнала, который определяется как эталонный базовый унифицированный для измерений амплитуды; и время начала работы ‘APD’ – Время начала измерений продолжительности. Это те же самые варианты для определения времени активации изохрональных карт (обсуждается ниже) и называются: Начало (d2F/dt2max), Upstroke (dF/dtmax), Середина деполяризации (время 50% амплитуды), Пик (время максимальной амплитуды). Эти определения, применяемые к мыши и морских свинок потенциалы действий показаны на рисунке 2A.ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение любого из этих параметров автоматически обновит карту продолжительности и таблицу результатов. Также доступны масштаб карты и варианты удаления выбросов. Скорость проводимости также измеряется автоматически в рамках основного программного интерфейса. Это достигается с помощью многовекторного метода Bayly et al26 с изохрональной карты, определяемой выбранной мерой активации (обсуждается в шаге 5.4). Очки активации нажатия для визуализации 3D-представления карты активации. Метод измерения многовекторной скорости проводимости пространственно сегментирует изохрональную карту на области n х n пикселей. Установите значение n с помощью ввода локального размера окна и установите диапазон времени активации для применения анализа с использованием входов времени установки. ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого локального региона, полиномальной поверхности, f, устанавливается, что лучше всего описывает связь между временем активации и пространственное положение, (x,y). Вектором градиента, локальным CV,этой поверхности затем вычисляется как:(1)где обозначает двухмерный оператор пространственного дифференциала26. Для каждого пикселя на изохрональной карте рассчитывается локальный вектор, представляющий скорость и направление проводимости. Выберите Isochronal Map с векторами из меню выпадения дисплея, чтобы просмотреть этот анализ. SNR рассчитывается как отношение максимальной амплитуды по сравнению со стандартным отклонением сигнала на базовом уровне. Этот анализ выполняется после всех этапов обработки. Вычислить Press SNR в верхнем меню для изменения настроек на период сигнала, определяемого как базовый. 6. Модуль анализа проводимости Пресс-проводка для получения более детального анализа скорости проводимости. Это открывает отдельный модуль, где проведение может быть количественно с помощью многовекторного метода Bayly, как в основном интерфейсе, методы одного переносчика, и как кривая активации. Нажмите «Единый вектор» для анализа проводимости с помощью метода единого переносчика, где cv рассчитывается из задержки времени активации между двумя точками. Это можно сделать с помощью автоматических или ручных методов, выбираемых ниже кнопки «Единый вектор». Для автоматического метода одного переносчика выберите расстояние и точку старта, с которой можно измерить проводимость. Программное обеспечение будет выполнять 360-градусный развертки из выбранной точки, измерения задержки времени и расчета сопутствующей скорости проводимости по всем направлениям в 1-градусный шагом. Результаты этого анализа отображаются на графике, прилегающем к карте, а направление медленной проводимости отображается красным цветом. Для ручного метода одного переносчика выберите как старт, так и конечную точку с изохрональной карты для расчета скорости проводимости. Чтобы выбрать новую точку старта, нажмите Clear StartPoint. Нажмите на локальный вектор, чтобы применить многовекторный метод, с настройками, соответствующими тем из основного интерфейса. В модуле дирижировании может отображаться распределение скорости дирижировать, а также угловое распределение расчетных векторов и угловая зависимость скорости проводимости. Кривая активации пресса для сметы процент ткани, активированной в качестве функции времени. Автоматически отображается время до 100% активации, в то время как пользовательские значения для минимальных (синих) и максимальных (красных) процентов активации между которыми также могут быть выбраны. 7. Дополнительные анализы и модули Помимо автоматически выполненных анализов продолжительности и скорости проводимости, несколько других параметров могут быть количественно с помощью ElectroMap. Эти анализы выбираются из меню выпадения над картой отображения. Выберите один из этих вариантов для выполнения анализа, и результаты будут отображаться в4-м ряду таблицы результатов: 1) Диастолический Интервал – Время от 90% реполяризации до времени активации следующего потенциала действия; 2) Доминирующая частота – Частотный спектр каждого пикселя рассчитывается с помощью быстрого преобразования Фурье, а частота с наибольшей мощностью определяется как доминирующая частота. Расширенный диапазон и настройки окон для доминирующего анализа частотдоступны, выбрав частотное картирование; 3) Время к пику – Время роста между двумя выбранными процентами пользователей (по умолчанию от 10 до 90%) фазы деполяризации потенциала действия или высвобождения кальция. Значения процентных ставок могут быть изменены, выбрав настройки ТТП; и 4) Расслабленная постоянная (к) – Констант релаксации рассчитывается путем установки моноэкспоненциального распада формы:(2)где уровень флуоресценции в то время t зависит от пика флуоресценции, F0, и последующего распада (C является постоянным)27. Значение, между которым и соответствовать уравнению 2, можно выбрать в основных пользовательских интерфейсах ElectroMap, а также добро критериев исключения соответствия, основанных на значении r2. Нажмите на единый анализ файлов, чтобы открыть специальный модуль для анализа высокой пропускной информации и проводимости каждого идентифицированного сегмента в файле. Анализ может быть выполнен либо на всем изображении (длительность, время проведения и активации), либо по отдельным регионам или достижимым точкам (в настоящее время только продолжительность). Результаты выводятся в файл .csv.ПРИМЕЧАНИЕ: Для значений APD из всего изображения, первый столбец в файле .csv является средним, в то время как второй столбец является стандартным отклонением. Нажмите Alternans инициировать автономный модуль для выделенного анализа и отображения бить-бить изменчивости. Подробную информацию о вариантах обработки и анализа alternans можно посмотреть на O’Shea et al. 2019 2019. В частности, этот модуль предназначен для определения двух периодных колебаний, известных как переменные. Рассчитаны и вычисляются как длительность, так и амплитуды.ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность переменных измеряется путем сравнения измерения продолжительности от одного пика к следующему; т.е. если пик один и два и APD1 и APD2 соответственно, то продолжительность череднана (ЗАПД) рассчитывается как(3)Измерение продолжительности выполняется с использованием настроек в основном интерфейсе. Между тем, амплитуда переменных могут быть количественно и отображены через многоклеточных препаратов, как абсолютное изменение (определяется как процент, где 0% – же амплитуда между одним ударом и другой). Кроме того, последствия таких явлений, как нагрузка кальция могут быть дополнительно исследованы путем измерения и сравнения нагрузки и выпуска переменных, как было ранее сообщалось28. Если L определяется как пика амплитуда больших ударов (т.е. где амплитуда больше, чем предыдущий удар), S амплитуда малых ударов, иD диастолическая нагрузка малых ударов, релиз чередовок ( ) определяются как:(4)И наоборот, переменныенагрузки () определяются как:(5)Alternans измерения могут быть сделаны по всей ткани, и результаты анализа отображаются в правом нижнем углу модуля. При первом использовании модуля анализ выполняется по всему экспериментальному файлу, а полученные результаты представляют собой среднюю разницу в ритме по всему файлу. Тем не менее, анализ может быть ограничен определенным временем в файле путем де-выбора Hold Увеличить, масштабирование на определенный период времени, и выбор анализа увеличеннойсекции. Это позволит обновить панель результатов, чтобы показать анализ выбранного периода времени. Выберите игру, чтобы показать бить-к-бить видео анализа переменных. Кроме того, выберите Создать среднюю карту для экспорта карты поведения переменных, усредненные из точек выбора времени, которые установлены в всплывающем меню при использовании этой функции. Карта фазы прессы для инициирования модуля отображения фазы. Преобразование Гильберта выполняется для расчета мгновенной фазы (между -й и я) сигналов в каждой временной точке. Нажмите кнопку воспроизведения или перетащите ползунок, чтобы визуализировать поведение фазы с течением времени и нажмите на пиксель, чтобы визуализировать фазовую диаграмму. 8. Данные об экспорте Данные экспортируются из ElectroMap в различных формах. Нажмите экспортные значения, чтобы сохранить значения отображаемых в настоящее время карты в основном используемом интерфейсе. Измеренные значения могут быть сохранены как карта (сохранение местоположений пикселей) или конденсированы в единый список, и могут быть сохранены как .csv,.txt или . Файлы MAT. Press Export Map, чтобы поднять всплывающее окно, содержащее в настоящее время отображаемую карту, которая затем может быть сохранена в различных форматах изображений. Параметры отображения карты контролируются путем выбора настроек карты, но также могут быть отредактированы после того, как будет выбрана карта экспорта. Например, цветовая панель может быть добавлена, выбрав этот значок из верхнего меню, и шкала может быть установлена, выбрав Edit Видео активации прессы для визуализации анимации последовательности активации, которая может быть сохранена в виде анимированного файла .gif. Видео сегмента прессы для сохранения видеофайла .avi ототображаемого параметра каждого идентифицированного сегмента.

Representative Results

Вся работа, выполненная в рамках этого исследования, была проведена в соответствии с этическими нормами, изложенными Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года и Директивой 2010/63/ЕС Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях. Эксперименты были одобрены домашним офисом (мышь: PPL 30/2967 и PFDAAF77F, морская свинка: PPL PF75E5F7F) и институциональными наблюдательными советами в Университете Бирмингема (мышь) и Королевском колледже Лондона (морская свинка). Подробные методы сбора необработанных данных, которые были проанализированыздесь, можно найти в наших предыдущих публикациях 5,6,14,19. Основной интерфейс, с помощью которого контролируется ElectroMap, показан на рисунке 1A. Необходимые шаги для анализа набора данных контролируются в основном изображениями нагрузки, обработкой изображений и кнопками «Продукция карты» и отображаются зеленым, синим и красным цветом соответственно на рисунке 1A. На рисунке 1B-D показаны операции, возникающие при выборе каждой из этих кнопок. Загрузка Изображения применяет параметры порогового изображения, выбранные пользователем (рисунок1B), в то время как процесс изображения (рисунок1C) применяетфильтрацию и базовую коррекцию. Наконец, Produce Maps сначала будет средней информации в соответствии с настройками временного окна и сегментации (если не выбрана сегментация одного удара), а затем выполнять анализы, описанные выше. Ключевым аспектом ElectroMap является его гибкость в отношении типа камеры и экспериментальной модели. Это имеет решающее значение для полезности оптического картографического программного обеспечения из-за различных сердечных EP и анатомических характеристик, которые существуют между широко используемыми моделями. Рисунок 2A, например, показывает, действия потенциал морфологии мурин триа по сравнению с желудочка морской свинки, записанные с использованием напряжения чувствительных красителей, как сообщалось ранее6,14. Несмотря на четкую форму потенциала действия и использование двух отдельных оптических картографических камер с различными частотами кадров и размерами пикселей, ElectroMap может быть использован для успешного анализа обоих наборов данных. Однако для этого необходимо изменить некоторые параметры в пользовательском интерфейсе(рисунок 2B). Обратите внимание, что длительный потенциал действий морских свинок требует большего временного окна. Кроме того, чтобы предотвратить коррекцию верхней шляпы базовой линии нефизиологически изменяя оптически записанные сигналы, его длина времени должна быть увеличена так, чтобы она была больше, чем временной ход потенциального действия. ElectroMap предлагает множество вариантов обработки, чтобы помочь улучшить SNR оптически записанных сигналов, которые могут потребоваться для эффективного восстановления параметров EP. Примером является автоматизированное усреднение ансамбля пиков после сегментации данных. Рисунок 3A-C демонстрирует, как применение усреднения ансамбля, вместо других методов, может улучшить SNR из изолированных муриновых левых атрии (n No 13). Это снижает неоднородность измерения и вероятность провала анализа(рисунок 3D). Например, изменение частоты темпа с 3 Гц до 10 Гц не изменило APD50, когда не происходит усреднения ансамбля, но ожидаемоеснижение APD50 на 10 Гц наблюдалось при измерении из усредненные данные ансамбля ( Рисунок 3E). Рисунок 4 демонстрирует эффективность и полезность автоматизированного определения частоты темпа, предлагаемого ElectroMap. Здесь мышь левой предипильности (n No 5) были темп на 120 мс длина цикла и длина цикла была постепенно сокращена на 10 мс, пока она не достигла 50 мс. ElectroMap автоматически определены темп цикла длины и сгруппированные ткани усредненные пики соответственно (Рисунок 4A ). Это было достигнуто с высокой точностью во всех наборах данных(рисунок 4B). Автоматизированная сегментация данных позволила провести простой и высокий пропускной процесс замедления скорости проводимости с увеличением частоты темпа/сокращенной длины цикла(рисунок 4C,D). Одновременно, APD50 (Рисунок 4E) и диастолический интервал (рисунок4F) сокращены. Амплитуда оптически измеренных пиков уменьшилась, в то время как время пика увеличилось (рисунок 4G,H). Это снова ожидаемые реакции реституции в сердечной ткани29,30 и использование ElectroMap может помочь поэтому прояснить изменения в ответ на темпчастоты в присутствии фармакологических агентов, генетическая модификация, или состояния болезней. Важным фактором в использовании программного обеспечения, такого как ElectroMap, является наличие артефактов в базовых данных. Рисунок 5, например, демонстрирует, что артефакты движения (искажение оптически записанного сигнала по движению ткани) могут исключить точные измерения активации и особенно реполяризации в ElectroMap. Смотрите Обсуждение для дальнейших соображений. Рисунок 1: Основные этапы обработки ElectroMap. (A) Графический пользовательский интерфейс ElectroMap, с изображениями нагрузки (зеленый), Процесс изображения (синий), и производить карты (красный) кнопки выделены. (B) Параметры порогового значения изображений, которые могут быть применены при выборе изображений нагрузки. (C) Параметры обработки сигнала, доступные пользователю, включают пространственную и временную фильтрацию и базовую коррекцию и могут быть применены к стеку изображения, нажав на ProcessImages. (D) Усреднение ансамбля и количественная оценка параметров (показано измерение APD), которое активируется при выборе ProduceMaps. Рисунок адаптированы из О’Ши и др., 201913. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Анализ данных о мыши и морских свинках с помощью ElectroMap. (A) Оптически записанный потенциал действия от мышей атрии и желудочков морских свинок, наряду с первым (df/dt) и вторым (d2f/dt2)производным от этих сигналов. Выделены различные определения времени активации и повторной поляризации в Рамках ElectroMap. (B) Скриншоты параметров обработки изображений и сигнала, используемых в интерфейсе ElectroMaps. Красные ящики подчеркивают параметры, которые требуют изменения между анализом данных мыши и морских свинок. Рисунок адаптированы из О’Ши и др., 201913. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Ансамбль усреднения для решения APD изменения. (A) APD50 карта и пример одного пиксельного сигнала от одного удара оптических потенциалов действия. (B) APD50 карта и пример одного пиксельного сигнала от оптических потенциалов действия, генерируемых ансамблем в среднем 10 последовательных ударов (пиковый метод). (C) SNR одного удара по сравнению с 10 бить усредненные сигналы. (D) APD50 неоднородности (i) и количество ошибок измерения (ii) в качестве функции SNR для одного удара и 10 бить в среднем APD50 карт. (E) APD50 на 3 и 10 Гц темп частоты, как измеряется из одного удара и 10 бить карты. (Данные, показанные как средняя – стандартная ошибка, n No 13 левой атрии, p slt; 0.001 по парному t-тесту студента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Использование ElectroMap для изучения частотных реакций в сердечной ткани. (A) Пример ElectroMap скриншот темпраспознавания частот и сегментации. (B) Сравнение известных и ElectroMap измеряется темп цикла длины. (C) Активация карты на 120 мс и 60 мс темп цикла длины. (D-H) Группированные данные скорости проводимости (D), APD50 (E), диастолический интервал (F), амплитуда (G), и время пика (H) в зависимости от скорости темпа длины цикла уменьшается от 120 мс до 60 мс в 10 мс шагом. (Данные показаны как средняя – стандартная ошибка, n no 5 левая атрия) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Эффект артефактов движения. (A) APD50 карта. (B) Карта активации. (C) Пример сигналов из мест, отмеченных (кресты) на APD и активации карт. В области ткани, отмеченной красным крестом, сжатие не было успешно разъединено, искажая измеренный оптический сигнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Здесь мы представляем пошаговый справочник по использованию программного обеспечения с открытым исходным кодом ElectroMap для гибкого и многопеременного анализа сердечных оптических картографических наборов данных. Для успешного использования ElectroMap, данные изображения должны быть в .tif или . Форматы MAT. ElectroMap включает в себя несколько изменяемых пользовательских настроек. Как показано на рисунке 2A,это необходимо из-за широкой неоднородности, которая существует между экспериментальными моделями и оборудованием для визуализации. Это означает, однако, что настройки по умолчанию в программном обеспечении не всегда будут оптимальными, поэтому важным шагом в использовании программного обеспечения является настройка пользователем для их конкретной экспериментальной настройки. К ним относятся настройки камеры и временные шкалы, как показано на рисунке 2B. После того, как оптимальные настройки были найдены, они могут быть сохранены и перезагружены в более поздние времена, выбрав configurationFile.

Ключевыми преимуществами программного обеспечения являются внедрение автоматизированного измерения CL и сегментации сигналов. Эти особенности позволяют анализировать острые реакции в экспериментальных записях и расширять анализ, фокусируясь на изолированных одиночных ударах. После достижения желаемой сегментации модуль анализа единого файла позволяет автоматизированный анализ каждого отдельного сегмента (включая одиночные удары), реализуя высокопроизводительный анализ нескольких переменных по всей записи, выделяемый в один файл .csv. В сочетании, ансамбль усреднения группированных пиков является эффективным методом для улучшения качества шумных сигналов, который автоматически выполняется в ElectroMap. Тем не менее, усреднение ансамбля не является повсеместно полезным, например, в исследованиях бит-бить изменчивости. Таким образом, ElectroMap интегрирует один удар сегментации, чтобы избежать ансамбля усреднения, альтернативные варианты обработки для улучшения SNR (пространственная и временная фильтрация) и включает в себя модуль анализа Alternans для дальнейшего изучения и карты бить-бить изменчивость.

Наборы оптического картирования данных часто демонстрируют артефакты, такие как базовый дрейф и артефакты движения. Равным образом, генерируемые сигналы могут быть низкого качества из-за небольших размеров пикселей, короткое время экспозиции и низкие фракционные флуоресцентные изменения2. Эти факторы препятствуют эффективному и точному анализу поведения EP. Как уже говорилось, ElectroMap имеет несколько стратегий обработки для преодоления этих проблем. Однако применение этих алгоритмов к фундаментально низкокачественным/искаженным данным по-прежнему будет препятствовать эффективному анализу. Таким образом, SNR является одним из параметров, которые измеряются и отображаются в ElectroMap. Кроме того, пользователь может выбрать и сравнить сигналы из определенных регионов из образца с помощью модулей Pixel Info и Compare, что позволяет идентифицировать такие явления, как артефакты движения, показанные на рисунке 5,и соответствующие исключение данных.

В настоящее время ElectroMap не поддерживает удаление артефактов движения из исходных данных таким же образом, как и базовая коррекция. Таким образом, возможное будущее развитие программного обеспечения является включение движения артефакт удаления вычислительными методами, как было сообщено31,32. Кроме того, ElectroMap в настоящее время ограничивается изучением одного оптического сигнала. Однако для соотношения красителей и одновременного использования напряжения и красителей кальция требуется27,требуется одновременная обработка двух каналов длины волны. Интеграция двойного анализа сигнала, таким образом, является важным будущим дополнением к программному обеспечению. Расширение параметров анализа, применимых к аритмическим наборам данных, таким как отслеживание сингулярности фазы, в равной степени расширит сферу действия программного обеспечения33,34. Наконец, некоторые из описанных вариантов анализа также могут быть полезны при анализе данных картирования электродов. Действительно, ElectroMap был использован для анализа данных картирования электродов, несмотря на контрастные электрограммы волновой формы20,35, и дальнейшая оптимизация расширит его использование для этой модальности.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была профинансирована студентом EPSRC (Sci-Phy-4-Health Centre for Doctoral Training L016346) в D.P., K.R. и L.F., Wellcome Trust Seed Award Грант (109604/Q/15/) в D.P., Гранты Британского фонда сердца (PG/17/55/33087, RG/17/15/33106) в D.P. , Европейский союз (грантовое соглашение No 633196 «CATCH ME» для P.K. и L.F.), Британский фонд сердца (FS/13/43/30324 в П.К. и Л.Ф.; PG/17/30/32961 в P.K. и A.H.), и Фонд Leducq в P.K. JW поддерживается Британским фондом сердца (FS/16/35/31952).

Materials

MATLAB and Simulink R2018a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 94, 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, 609-623 (2012).
  3. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  4. Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local β-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation Research. 110, 1454-1464 (2012).
  5. Syeda, F., et al. PITX2 Modulates Atrial Membrane Potential and the Antiarrhythmic Effects of Sodium-Channel Blockers. Journal of the American College of Cardiology. 68, 1881-1894 (2016).
  6. Winter, J., et al. Sympathetic nervous regulation of cardiac alternans in the intact heart. Frontiers in Physiology. 9, 1-12 (2018).
  7. Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7, 313-320 (2014).
  8. Sato, P. Y., et al. Loss of Plakophilin-2 Expression Leads to Decreased Sodium Current and Slower Conduction Velocity in Cultured Cardiac Myocytes. Circulation Research. 105, 523-526 (2009).
  9. Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging & Visualization. 5, 368-378 (2017).
  10. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
  11. Crocini, C., Ferrantini, C., Pavone, F. S., Sacconi, L. Optogenetics gets to the heart: A guiding light beyond defibrillation. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 132-139 (2017).
  12. Entcheva, E., Bub, G. All-optical control of cardiac excitation: Combined high-resolution optogenetic actuation and optical mapping. The Journal of Physiology. 9, 2503-2510 (2016).
  13. O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  14. Yu, T. Y., et al. An automated system using spatial oversampling for optical mapping in murine atria. Development and validation with monophasic and transmembrane action potentials. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 340-348 (2014).
  15. Jaimes, R., et al. Functional response of the isolated, perfused normoxic heart to pyruvate dehydrogenase activation by dichloroacetate and pyruvate. Pflugers Archiv. 468, 131-142 (2016).
  16. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308, H1112-H1125 (2015).
  17. Parrish, D. C., et al. Transient denervation of viable myocardium after myocardial infarction does not alter arrhythmia susceptibility. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory. , (2017).
  18. Ihara, K., et al. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. Journal of Visualized Experiments. (132), e56478 (2018).
  19. Holmes, A. P., et al. A Regional Reduction in Ito and IKACh in the Murine Posterior Left Atrial Myocardium Is Associated with Action Potential Prolongation and Increased Ectopic Activity. Plos One. 11, e0154077 (2016).
  20. Lang, D., et al. Arrhythmogenic remodeling of β<inf>2</inf> versus β<inf>1</inf> adrenergic signaling in the human failing heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8, 409-419 (2015).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Wen, Q., et al. Transverse cardiac slicing and optical imaging for analysis of transmural gradients in membrane potential and Ca2+ transients in murine heart. The Journal of Physiology. 596, 3951-3965 (2018).
  23. Houston, C., et al. Characterisation of re-entrant circuit (or rotational activity) in vitro using the HL1-6 myocyte cell line. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 119, 155-164 (2018).
  24. Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging and Visualization. 5, 368-376 (2017).
  25. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
  26. Bayly, P. V., et al. Estimation of Conduction Velocity Vector Fields from Epicardial Mapping Data. IEEE Transactions on Bio-Medical Engineering. 45, 563-571 (1998).
  27. Jaimes, R., et al. A technical review of optical mapping of intracellular calcium within myocardial tissue. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310, H1388-H1401 (2016).
  28. Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: Ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation Research. 114, 1410-1421 (2014).
  29. Winter, J., Shattock, M. J. Geometrical considerations in cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis. Europace. , (2016).
  30. Mironov, S., Jalife, J., Tolkacheva, E. G. Role of conduction velocity restitution and short-term memory in the development of action potential duration alternans in isolated rabbit hearts. Circulation. 118, 17-25 (2008).
  31. Khwaounjoo, P., et al. Image-Based Motion Correction for Optical Mapping of Cardiac Electrical Activity. Annals of Biomedical Engineering. 43, 1235-1246 (2014).
  32. Christoph, J., Luther, S. Marker-Free Tracking for Motion Artifact Compensation and Deformation Measurements in Optical Mapping Videos of Contracting Hearts. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
  33. Umapathy, K., et al. Phase Mapping of Cardiac Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 3, 105-114 (2010).
  34. Tomii, N., et al. Detection Algorithm of Phase Singularity Using Phase Variance Analysis for Epicardial Optical Mapping Data. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63, 1795-1803 (2016).
  35. Cantwell, C. D., et al. Techniques for automated local activation time annotation and conduction velocity estimation in cardiac mapping. Computers in Biology and Medicine. 65, (2015).

Tags

Optical MappingCardiac ResearchElectrophysiology DataElectroMapMulti-arrayFluorescent DyesAction Potential DurationConduction VelocitySignal ProcessingRegion Of InterestThresholdMATLABHigh-throughput Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
O’Shea, C., Holmes, A. P., Yu, T. Y., Winter, J., Wells, S. P., Parker, B. A., Fobian, D., Johnson, D. M., Correia, J., Kirchhof, P., Fabritz, L., Rajpoot, K., Pavlovic, D. High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap. J. Vis. Exp. (148), e59663, doi:10.3791/59663 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image