Biomineralization er dannelsen av mineraler i nærvær av organiske molekyler, ofte knyttet til funksjonelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Biomineralization kan være intracellulære, som i dannelsen av magnetitt inne magnetotactic bakterier¹, eller ekstracellulære, som i dannelsen av kalsium, i sjø Urchin pigger², av hydroksyapatitt som er relatert med kollagen i Bones³ og emalje som er forbundet med amelogenin i tennene⁴. Biomineralization er en kompleks prosess som avhenger av mange parametre i den levende organismen. Derfor, for å forenkle systemet under studien, er det nødvendig å evaluere effekten av separate komponenter på prosessen. I mange tilfeller er biomineralization indusert av tilstedeværelsen av ekstracellulære biopolymerer. Formålet med metoden som presenteres her er som følger: (1) for å danne kalsium, og krystaller i nærvær av isolerte biopolymerer in vitro, ved hjelp av en damp diffusjon metode. (2) for å studere effekten av biopolymerer på morfologi og struktur av kalsium.

Tre viktigste metoder for å fremskynde kalsium, i vitro i nærvær av organiske tilsetningsstoffer brukes^5,6. Den første metoden, som vi vil referere til som løsningen metoden, er basert på å blande et løselig salt av kalsium (f. eks CaCl₂) med et løselig salt av Blandingsprosessen kan utføres på flere måter: inne i en reaktor med tre celler som er adskilt av porøse membraner⁷. Her inneholder hver av de ytre cellene et løselig salt og den sentrale cellen inneholder en løsning med tilsetningsstoff som skal testes. Kalsium og overflate diffus fra den ytre til den midterste cellen, noe som resulterer i utfelling av den mindre løselige kalsium-veggen når konsentrasjonene av kalsium og andre overskrider deres løselighet produkt, K_SP = [ca^{2 +}] [co₃ ^2-]. En ekstra blanding metoden er dobbel-Jet prosedyre⁸. I denne metoden injiseres hvert løselig salt fra en separat sprøyte til en rørt løsning som inneholder tilsetningsstoffet, der kalsium precipitates. Her injeksjon og derfor blande hastigheten er godt kontrollert, i motsetning til den forrige metoden der miksing er kontrollert av diffusjon.

Den andre metoden som brukes til å utkrystallisere CaCO₃ er den Kitano metoden⁹. Denne metoden er basert på likevekt/hydrogen-balanse (2HCO₃^– _(AQ) + ca^{2 +}_(AQ) caco_{3 (s)} + co_{2 (g)} + H₂O _(l)). Her, CO₂ er boblet til en løsning som inneholder caco₃ i en solid form, skiftende likevekt til venstre og derfor oppløses av kalsium. Den uoppløste kalsium er filtrert og ønsket tilsetningsstoffer er lagt til bikarbonat-rik løsning. CO₂ er da lov til å fordampe, og dermed skiftende reaksjonen til høyre, forming kalsium i nærvær av tilsetningsstoffene.

Den tredje metoden for kalsium på krystallisering, som vi vil beskrive her, er dampen diffusjon metoden¹⁰. I dette oppsettet, den organiske tilsetningsstoff, oppløst i en løsning av kalsiumklorid, er plassert i et lukket kammer nær ammonium i pulverform. Når ammonium dekomponerer inn i karbondioksid og ammoniakk, diffus de inn i oppløsningen som inneholder kalsium ioner (f.eks. CaCl₂), og det er utløst kalsium (se figur 1 for illustrasjon). Den kalsium med krystaller kan vokse ved langsom nedbør eller ved rask nedbør. For langsom nedbør plasseres en løsning som inneholder tilsetningsstoffet i CaCl₂ -løsningen, i en desikator ved siden av ammonium. I den raske nedbøren, beskrevet i lengden i protokollen, er både additiv løsning og ammonium, plassert tettere sammen i en multi-brønn plate. Den langsomme nedbørs metoden vil produsere færre kjerne sentre og større krystaller, og den raske nedbøren vil føre til mer kjernedannelse sentre og mindre krystaller.

Metodene som er beskrevet ovenfor, varierer i deres tekniske kompleksitet, i nivået av kontroll og i hastigheten på nedbørs prosessen. Blandings metoden krever et spesielt oppsett⁶ for både dobbel stråle og tre celle system. I miksing metoden, tilstedeværelsen av andre oppløselige Counter ioner (f. eks na⁺, CL^–)⁶ er uunngåelig, mens i Kitano metoden, kalsium og (BI) er de eneste ioner i løsningen, og det innebærer ikke tilstedeværelsen av ytterligere (f. eks na⁺, CL^–). Videre, blande metoden krever relativt store volumer og derfor er det ikke egnet for å arbeide med dyre biopolymerer. Fordelen med dobbel stråle er at det er mulig å kontrollere frekvensen av løsnings injeksjon og at det er en rask prosess i forhold til andre metoder.

Fordelen med Kitano metoden og damp diffusjon metoden er at dannelsen av kalsium er kontrollert av diffusjon av CO₂ inn/ut av en CaCl₂ -løsning, og dermed tillater å undersøke tregere kjernedannelse og utfelling prosesser ¹¹ flere ^{, 12}. Videre kan kalsium-formasjonen ved diffusjon av co₂ ligne forkalkning prosesser i vivo^13,14,15. I denne metoden, veldefinerte og separerte krystaller dannes¹⁶. Til sist kan effekten av enkelt-eller fler biopolymerer på dannelse av kalsium, testes. Dette gjør det mulig med en systematisk studie av effekten av en rekke tilsetnings konsentrasjoner på kalsium og en studie av blandinger av biopolymerer-alt utført på en kontrollert måte. Denne metoden er egnet for bruk med et stort utvalg av konsentrasjoner og mengder tilsetningsstoffer. Minimalt volum som brukes er omtrent 50 μL, og derfor er denne metoden fordelaktig når det er en begrenset mengde av de tilgjengelige biopolymerer. Det maksimale volumet avhenger av tilgjengeligheten til en større brønn plate, eller desikator som platen eller begeret med CaCl₂ skal settes inn i. Metoden som er beskrevet nedenfor er optimalisert for arbeid i en 96-brønn plate med en Biopolymer valgt å være proteinet tapas¹⁷.