由康卡纳林注射到乳原区引起的水性干眼病的兔子模型：药物功效研究的应用

所有动物研究均获得石溪大学机构审查委员会的批准，并根据《关于在眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明》进行。 1. 动物和住房 收购新西兰白（NZW）兔子重2-3公斤。 将兔子单独关在笼子里，温度严格（65 ~ 5 °F）和湿度（45 ± 5%）控制。照明应具有 12 小时的开/关周期。 提供无限制的水和标准兔舍。消除饮食丰富，因为它们可能含有影响眼睛的维生素A。 在基线测量或干眼感应之前，使动物适应至少 2 周。 2. 麻醉和安乐死的方法 注：除需要中度镇液的Con A注射外，所有程序均需要轻度镇液。 对于轻度镇滑，使用26号针在肩部下皮注射丙丙丙酮（1mg/kg）。轻度镇定终点：动物保持宽松的头部位置，耳垂不再完全直立。注： 如果未达到适当的端点，则可能会额外注射丙丙酮。动物应该始终保持清醒，对触摸它们的胡须作出反应，并且不要表现出呼吸的减慢。 对于中度镇化，首先给动物如上所示的丙丙酶。到达端点后（见上面的说明），使用 O2流量设置为 1 L/min 且等氟传递设置为 5%的防毒面具给分路胶（图2）。 管理除虫，直到兔子的身体色调完全放松，耳朵是完全软盘。注意：当动物侧翻时，不应发生补偿性肌肉运动;呼吸总是自发的。 自发恢复发生在2-5分钟内：迹象包括自发性头部运动和增加或正常的肌肉张力。在适度镇颤实验程序完成后，观察兔子约30分钟或直到它们的行为恢复正常。注：在任一形式的镇颤期间，不需要眼部膏。1） 在轻度镇静中，动物仍然警觉并保持眨眼反射。在中度镇颤中，对眨眼反射的抑制非常短，以至于眼部表面没有危险。2） 在眼部表面放置眼软膏，使测试期间评估的结构无法可视化。 安乐死：使用过量的静脉注射五巴比妥（100毫克/千克）。 3. 去除补膜 在适应期（通常是第一周）进行切除，以便对角膜进行完整和准确的评估。 注射到右侧补膜注：如果要去除两只眼睛的膜，在一个会话中执行此操作是最简单的。从一只眼睛开始，按照描述继续。为了清楚描述，此方法从右眼开始。 将兔子放在一个适当大小的限制袋中。 如步骤 2.1 所述，诱导轻度镇颤。 使用微移液器将25μL的无防腐剂利多卡因涂抹在右眼。 在眼睑之间放置一个灵活的钢丝盖规格。 使用 0.3 钳子（或等效），抓住顶点的补膜并将其扩展到角膜上。 使用26号锋利针将利多卡因1%与1：100，000肾上腺素亚结膜注射到膜底（图3A）。在补膜上应形成一个中度球。 拆下规格。 对左补膜进行相同的注射。 切割补膜 大约 5 分钟后，将盖子规格放回右眼。使用 0.3 钳（或类似）抓住并缩回其顶点的补扣膜。 使用韦斯特科特剪刀或等效剪刀将其底座上的薄膜切下（图3B）。注：出血量最小，通常不需要烧灼。然而，高温电池烧灼始终保存在附近，以防需要额外的节位。 拆下规格。 将局部抗生素膏放在眼睛上（例如，新霉素、多霉素、巴氏素和氢皮质酮）。 保持硬体腺完好无损。当膜缩回时，有时会看到硬质腺体。注：如果在去除膜后在鼻腔或上部亚结膜区域看到较大的白色质量或组织高程，则膜被切除太靠近其基部，使哈道腺自发脱垂。为了防止在后续过程中出现这种情况，请将更多的防化膜留在底座上。 在进行进一步操作或进行眼表面测定之前，让眼部表面愈合至少 1 周。 4. 测量干眼参数和收集泪样 注：根据研究协议需求（例如，在基线和之后指定的时间点）测量DED参数。DED 的测量应按以下顺序进行，并经过严格努力，每次都忠实地复制它们。在一天中大约同一时间（± 1 h）测试所有动物，以尽量减少昼夜变化。这些测量通常需要两个调查员团队。 把兔子放在一个限制袋里。诱导轻度镇颤。 撕裂渗透性22 手动闪烁眼睑 5-10 次，将撕裂层均匀分布于眼表面。 轻轻缩回下盖。 沿下一个圆角的胸膜和牛胸结膜的交界处使用 TearLab Osmometer 进行检测，正好是截断膜底部的后部。 按照制造商的说明，使用”撕裂实验室渗透性”测试测量渗透度。 撕裂时间（TBUT） 使空间变暗，以便进行此测定。 在眼睑之间放置一个钢丝盖。 使用微移液器在角膜表面涂抹 50 μL 降 0.2% 的荧光蛋白。如果第一滴没有获得角膜上的荧光辛均匀分布，则放置第二滴。 立即启动计时器。 在蓝光下观察角膜前撕裂膜。TBUT 被定义为开发黑点、线条或荧光片明显中断所用的时间（图4）。如果需要，请使用提供±1.50放大倍率的手术放大镜，以更好地可视化分手的早期迹象。最多 1 分钟监控;如果此处定义的分手发生在 1 分钟后，则记录 TBUT 仅为 60 秒。 希尔默的撕裂测试（STT） 在眼部表面涂抹25μL无防腐剂利多卡因。 将韦克细胞手术矛放入劣质的fornix中，以吸收残留的利多卡因和任何泪液。如果需要，使用下眼睑覆盖海绵的近端，以帮助保持其到位（图5A）。 大约 30 s 后，取出韦克海绵。 立即将Schirmer的撕裂测试条插入角膜和下盖中点眼膜结膜之间的空间。 立即启动计时器 （图 5B）。 5分钟后，测量条带湿润部分的长度;这是 STT 值。 以三重值执行度量值，并将 3 个读数的平均值报告为 STT 值。 眼泪样本的收集 要收集泪液样本，以检测其中各种分析物（如乳铁蛋白）的检测水平，在 STT 值记录在 5 分钟后，请保持条带原位，直到获得至少 20 mm 的润湿。注：如果在诱导 DED 后未发生足够的润湿，则将条带深入下部，以帮助在合理时间内到达此端点。 切湿条，并立即放入490μL的冷冻催泪液（4%BSA，1M NaCl，0.1%补间-20在PBS与蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。 将样品保存在冰上，直到样品储存在-80°C，直到测定为止。 玫瑰孟加拉染色（RBS） 使用微移液器在角膜上涂抹 50 μL 的 1% 无防腐剂利多卡因。 30 s 后，将 25 μL 的 1% 玫瑰角放在眼表面，然后手动眨眼皮均匀分布。 立即启动计时器。 3.5 分钟时，在盖子之间放置一个钢丝盖规格。 4.0分钟，拍摄高级结膜和角膜表面（图6）。注：根据正在使用的摄像机类型进行调整。典型设置：数字单镜头反光相机、光圈优先模式（光圈 13 或更大）、ISO 6000、100 mm 微距镜头，并配有两个 12.5 mm 扩展管、手动对焦模式、最大放大倍率镜头以及从微距/环闪光灯设置为自动通过镜头模式的照明。环形闪光灯对焦灯打开，以帮助聚焦角膜。 在 1 分钟内完成两只眼睛的所有照片。 分数眼表面染色使用NEI方法23修改如下。不要等级 6 单独的结膜区。得分每个眼睛的优等结膜。这是结合表面的部分，无需操纵地球即可轻松拍摄。操作可以切实改变眼部表面的染色。 泪乳铁蛋白水平是从乳腺中产生撕裂的代用品。根据制造商的说明，使用酶连结免疫吸附剂测定24试剂盒，测定上述眼泪中收集的泪乳铁蛋白。 5. 干眼的诱导和治疗 注：注入轨道乳腺系统的三个部分。 将兔子用0.2毫克/千克的醋酸亚皮下。 切掉轨道和头皮区域的毛皮，并使用奈尔完全去除任何残留的毛皮。保持皮肤完全光滑，以更好地可视化解剖特征和美国指导注射的康卡纳平A（图7）。 如上文所述，诱导中度镇化。 注射高级乳胶体 （PSLG） 的苍白部分注：首先执行PSLG注射。 用微移液器涂抹于适当的眼睛25 μL无防腐剂利多卡因1%。 恒上眼睑，并施加温和的中压后轨道边缘，直到出现标记腺体苍白部分的突起。PSLG 在上盖的后部（时态）部分显示为小球状高程。注：要在学习过程中查看腺组织，请向区域应用5%的荧光成因（图8A）。眼泪可以看到流从球状PSLG。在Con A的管理中不需要使用荧光管;它仅用于说明目的，以显示腺组织。 使用细齿钳和27量表针在结核蛋白注射器上，直接穿透腺体使用转结膜方法。将针头推进2毫米进入组织，在0.1 mL的体积下注射500μg的Con A（图8B）。注：这种注射有时可能是痛苦的。如有必要，将动物放在离尼氏体下，直到注射完成。 轨道高级乳胶体（OSLG）的注入注：OSLG 迅速跟随。 对地球施加中压，使 OSLG 从后部保险中突出（如果需要，请参阅参考25进行解剖）。用后切口的OSLG向地球施加中压（图9，红色箭头）。突起作为总本地化，以找到后保险。 使用弯曲的钳子，用尖头关闭，以缩进区域，直到头骨的骨开口被感觉到。这将像在突起下的前/后方向一样裂开。 用钳子施加适度的压力，在皮肤中留下凹痕，这将成为针扎的地标（图10A）。 将针头（带 27 米、5/8 英寸针头的结核针）垂直于皮肤的缩进标记（图 10B）= 1⁄4 英寸进入切口，然后从后部和外部将针头重定向到侧射器，瞄准注射部位和骨轨道边缘之间的中点。注：如果保险不是用针精确瞄准的，头骨会阻碍其前进。 到达针的轮毂后，在 0.2 mL 的体积中缓慢注入 1000 μg 的 Con A（图 10C）。 在 2-3 分钟内完成 PSLG 和 OSLG 的注入。 将动物从异脱镇化（如果尚未完成）中取出。注射劣质乳胶腺（ILG）通常无需进一步镇精即可完成。 注射劣质乳胶体 从侧面查看动物。ILG的突出性可以沿轨道的下前部分看到（图11A）。 使用手术标记笔或适当的永久性标记在皮肤上绘制一条垂直线，其中 ILG 腺体的表面部分从其表面（更外在）静止位置过渡到其在轨道上的更中位位置。这通常不如前肢 （图 11A）. 通过在皮肤上扫过这条线的垂直持有的美国探针，识别酶骨的末端。ILG 过渡发生在腺体图像从明显被限制（沿图像的腺体下边缘看到酶骨的超回声线）变为没有可识别的内边界（酶骨回波不再存在，图 1）。 当美国屏幕显示此更改时，观察手件与皮肤上绘制的线条的相对位置。这是应该给出 Con A 的”注射站点”。 控制注射深度，使 Con A 放入腺体中，正好与酶弓骨的中位。 确定注射深度如下：将所需的注射深度设置为酶骨的深度（高回音信号）加1 mm。从已知针的长度（本例中为15 mm）中减去此值。 将针头插入”注射部位”±12 mm处的腺体中，然后慢慢取出，直到外露的针头长度（用手术卡钳测量）等于5.8.6计算的差值（图12）。在 0.2 mL 中注入 1000 μg 的 Con A。注：为确保腺体胶囊被刺穿，而不是简单地由针头推动，在取下之前，针头应插入+12 mm或几乎插入轮毂。 重复美国，以确认注射成功。ILG 应显示一个典型的低附声空间 （图 1）。注：ILG注射是动物26最能容忍的注射，因此，最后完成。 完成整个过程，在10分钟内注射两眼的所有腺体。这将要求在程序中达到能力。注：一组注射到2个轨道乳胶腺将诱发持续1-2周的急性DED。 对于持续时间较长的 DED，每 7 天注入 Con A。已成功执行多达 6 次此类注射。 6. 手术后护理 注射Con A后，在限制袋中监测动物至少10-20分钟，或直到麻醉效果减弱。 不要让动物无人看管，直到它们恢复足够的意识来维持胸腔。在完全恢复之前，不要将它们送回各自的笼子。 手术后疼痛通常比较轻微，持续不到48小时。如果需要，给予一剂皮下酮洛拉（5毫克/千克）。对于更严重的疼痛，每8小时给予皮下丁丙诺啡0.1毫克/千克。