Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus
Summary
Presentiamo un protocollo per studiare la regolazione della traduzione di mRNA nelle cellule infettate da Poxvirus usando il saggio reporter di luciferasi basato sull’RNA trascritto in vitro. Il saggio può essere utilizzato per studiare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elementi di un mRNA, tra cui 5′-non tradotto regione (UTR) e 3′-UTR. Diverse modalità di avvio della traduzione possono anche essere esaminate utilizzando questo metodo.
Abstract
Ogni poxvirus mRNA trascritta dopo la replicazione virale del DNA ha un leader di 5′ poli (A) evolutivamente conservato, non-templato nel 5′-UTR. Per dissezionare il ruolo di 5′-poli (a) leader nella traduzione di mRNA durante l’infezione da Poxvirus abbiamo sviluppato un saggio reporter luciferasi basato su RNA trascritto in vitro. Questo saggio reporter comprende quattro fasi principali: (1) PCR per amplificare il modello di DNA per la trascrizione in vitro; (2) trascrizione in vitro per generare mRNA utilizzando T7 RNA polimerasi; (3) trasfezione per introdurre mRNA trascritto in vitro in cellule; (4) rilevazione dell’attività di luciferasi come indicatore della traduzione. Il saggio reporter a base di RNA luciferasi descritto qui aggira i problemi della replicazione plasmide nelle cellule infettate da poxvirus e nella trascrizione criptica dal plasmide. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elements in un mRNA comprendente 5′-UTR e 3′-UTR in sistemi diversi dalle cellule infettate da Poxvirus. Inoltre, è possibile studiare diverse modalità di iniziazione alla traduzione come il CAP-dipendente, il CAP-Independent, la riiniziazione e l’iniziazione interna utilizzando questo metodo.
Introduction
Secondo il dogma centrale, le informazioni genetiche fluiscono dal DNA all’RNA e poi infine alla proteina1,2. Questo flusso di informazioni genetiche è altamente regolamentato a molti livelli, tra cui la traduzione di mRNA3,4. Lo sviluppo di saggi reporter per misurare la regolazione dell’espressione genica faciliterà la comprensione dei meccanismi normativi coinvolti in questo processo. Qui descriviamo un protocollo per studiare la traduzione di mRNA utilizzando un saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro in cellule affette da Poxvirus.
I poxvirus comprendono molti patogeni umani e animali altamente pericolosi5. Come tutti gli altri virus, i poxvirus si basano esclusivamente su macchine a cellule ospitanti per la sintesi proteica6,7,8. Per sintetizzare efficacemente le proteine virali, i virus hanno sviluppato molte strategie per dirottare la macchina traslazionale cellulare per reindirizzare la traduzione di mRNAs virale7,8. Un meccanismo comunemente impiegato da virus è quello di utilizzare elementi di azione CISnelle loro trascrizioni. Esempi degni di nota includono il sito di ingresso ribosoma interno (IRES) e il potenziatore di traduzione indipendente da Cap (Cite)9,10,11. Questi elementi CISrendono le trascrizioni virali un vantaggio traslazionale attirando macchinari traslazionali attraverso diversi meccanismi12,13,14. Oltre 100 mRNA di poxvirus hanno un elemento di azione CISevolutivamente conservato nella regione 5′-non tradotta (5′-UTR): un 5′-poli (a) leader alle 5′ estremità di questi mRNAs15,16. Le lunghezze di questi 5′ poli (A) leader sono eterogenei e sono generati dallo slittamento della polimerasi RNA codificata da Poxvirus durante la trascrizione17,18. Noi, e altri, recentemente abbiamo scoperto che il 5′ poli (a) leader conferisce un vantaggio di traduzione a un mRNA in cellule infettate con virus vaccinia (VACV), il prototipo membro di poxvirus19,20.
Il saggio reporter luciferasi basato su RNA trascritto in vitro è stato inizialmente sviluppato per comprendere il ruolo del leader 5′ poli (a) nella traduzione di mRNA durante l’infezione da Poxvirus19,21. Anche se i saggi del reporter di luciferasi basati sul DNA plasmide sono stati ampiamente utilizzati, ci sono diversi inconvenienti che complicheranno l’interpretazione dei risultati nelle cellule infettate da Poxvirus. In primo luogo, i plasmidi sono in grado di replicare in cellule infettate da VACV22. In secondo luogo, la trascrizione criptica si verifica spesso da plasmide DNA18,23,24. In terzo luogo, la trascrizione basata sul promotore VACV genera poli (A)-leader di lunghezze eterogenee, rendendo quindi difficile controllare la lunghezza del leader Poly (A) in alcuni esperimenti18. Un saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritta in vitro aggira questi problemi e l’interpretazione dei dati è semplice.
Ci sono quattro passaggi chiave in questo metodo: (1) reazione a catena della polimerasi (PCR) per generare il modello di DNA per la trascrizione in vitro; 2) trascrizione in vitro per generare mRNA; 3) trasfezione per consegnare l’mRNA nelle cellule; e (4) rilevazione dell’attività di luciferasi come indicatore della traduzione (Figura 1). Il risultante amplicon PCR contiene i seguenti elementi in 5′ a 3′ direzione: T7-promoter, poli (A) leader o desiderato 5′-UTR sequenza, lucciola luciferasi aperta cornice di lettura (ORF) seguita da una Poly (A) coda. La PCR amplicon è utilizzata come modello per sintetizzare mRNA mediante trascrizione in vitro utilizzando la T7 polimerasi. Durante la trascrizione in vitro, m7G CAP o altro tappo analogico è incorporato in mRNA recentemente sintetizzato. Le trascrizioni limitate vengono trasfusate in cellule non infette o infette da VACV. Il lisato cellulare viene raccolto al momento desiderato dopo la trasfezione per misurare le attività di luciferasi che indicano la produzione di proteine da mRNA trasfected. Questo saggio reporter può essere utilizzato per studiare il regolamento di traduzione da CIS-element presente in 5′-UTR, 3′-UTR o altre regioni di un mRNA. Inoltre, il saggio in vitro trascritto a base di RNA può essere utilizzato per studiare diversi meccanismi di iniziazione alla traduzione, tra cui l’iniziazione dipendente dalla PAC, l’iniziazione indipendente dal tappo, la riiniziazione e l’iniziazione interna come IRES.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tutti i passaggi a quattro core sono fondamentali per il successo del saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro. Particolare attenzione deve essere prestata alla progettazione del primer, in particolare per la sequenza di promoter T7. T7 RNA polimerasi inizia la trascrizione dal primo G sottolineato (ggg-5′-UTR-Aug-) in T7 promoter aggiunto prima della sequenza 5′-UTR. Sebbene il sito iniziale di trascrizione (TSS) inizi dal primo G all’estremità 5′, diminuendo il numero di G inferiore a tre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto è stato finanziato dagli istituti nazionali di sanità (AI128406 www.nih.gov) a ZY e in parte dal Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) sotto forma di Graduate Student Summer stipend alla PD.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
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