İnsan blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon
Summary
Preimplantasyon Genetik testlerini verimli bir şekilde yürütmek için blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gereklidir. Zona pellucida ve 7-8 troectoderm hücrelerinin alma gün 5-7 Post-döllenme sıralı açılışı gerektiren bir yaklaşım, hem gerekli manipülasyonlar sayısını ve alt optimum çevresel koşullara embriyonun maruz kalma sınırlar.
Abstract
Preimplantasyon genetik testleri ile ıVF döngüleri sırasında güvenilir bir genetik tanı elde etmek için blastosist biyopsisi gerçekleştirilir. Daha sonra, ideal iş akışı, teşhis tekniklerinin dönüş süresi nedeniyle ve seçilen embriyo (lar) ı aşağıdaki doğal döngüde fizyolojik endometriyum üzerine aktarmak için güvenli ve verimli bir vitrifikasyon Protokolü gerektirir. Zona pellucida ‘nın sıralı açılmasını ve 5-10 troektoderm hücrelerinin (ideal 7-8) alınmasını kapsayan bir biyopsi yaklaşımı, hem gerekli manipülasyon sayısını hem de embriyonun alt-optimum çevresel koşullara maruz kalmasını sınırlar. Uygun eğitim sonra, teknik biyopsi zamanlaması açısından farklı operatörler arasında tekrarlanabilir oldu (~ 8 dakika, değişen 3-22 min embriyoların sayısına bağlı olarak biyopsi için tabak), kesin tanı elde (~ 97,5%) ve canlı Doğum oranları sonra vitrifiye-ısıtılmış euploid blastosist transfer (> 40%). Biyopsi sonrası hayatta kalma oranı, vitrifikasyon ve ısınma% 99,8 kadar yüksek oldu. Isınma 1,5 h yeniden genişleme oranı gibi yüksek oldu 97%, büyük ölçüde biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanlamaya bağlı (ideal ≤ 30 dk), blastosist morfolojik kalite ve biyopsi günü. Genel olarak, çökmüş bir blastokist vitrify daha iyidir; Bu nedenle, PGT olmayan döngüleri, lazerle destekli suni daralma embriyo çöküşü önce ağoprezervasyon için yapılabilir. En umut verici gelecek perspektif, blastosist kültürden sonra, embriyonik DNA ‘nın bir kaynağı olarak ıVF kültür ortamının non-invaziv analizidir. Ancak, bu potansiyel Avant-garde hala soruşturma altında ve güvenilir bir protokol henüz tanımlanması ve doğrulanması gerekir.
Introduction
Modern insan EMBRİYOLOJİSİ ana amacı, uyarı döngüsü başına sayı canlı doğumları maksimize etmek ve maliyetleri azaltmak için, zaman ve çabaları bir hamilelik elde etmek. Bu hedefi başarmak için, bir IVF döngüsü sırasında elde edilen bir kohort içinde üreme yetkin embriyoları belirlemek için embriyo seçimi için onaylanmış yaklaşımlar kullanılmalıdır. Son kanıtlara göre, blastosist kültür1 kapsamlı kromozomal test ve vitrifiye-ısıtılmış euploid embriyo transferi ile KOMBINE (et) IVF verimliliği artırmak için en verimli çerçeve2. Belli ki, aneuploidyen testi, günümüzde çoğunlukla troektoderm ‘den (TE) alınan birkaç hücreden temsil edilen bir embriyonik numune gerektirir, yani gebelikte embriyo eklerine (örn. plasenta) kökeni veren blastosist bölümü . Karyotip analizinin ötesinde, aynı zamanda tek gen mutasyonları, preimplantasyon genetik testleri (PGT;-aneuploidies için A-SR, yapısal kromozomal yeniden düzenlemeleri için-M monojenik hastalıklar için) olarak bilinen bir klinik strateji parçası olarak bir TE biyopsisi ile değerlendirilebilir. Diğer ooksit/embriyo biyopsisi yöntemleri teorik olarak son yıllarda klinik olarak benimsenmiştir, yani kutup organları biyopsisi ve plastomer biyopsisi. Ancak, günümüzde prosedürel dezavantajları (örn. daha yüksek iş yükü ve üreme etkisi riski) ve tanı sınırlamaları (örn. tek hücreli analiz sorunları) dolaylı olarak maliyetler, riskler ve (bir inceleme için bkz:3).
Bu yazıda, TE biyopsisi için ana protokollerden biri, sonraki vitrifikasyon, ısınma ve Transfer prosedürleri ile birlikte iyice tarif edilir. Burada özetlenen iş akışı, yoğun bir PGT ünitesi için idealdir.
Zaten bizim grup4,5tarafından önceden açıklanan, prosedür tam genişletilmiş blastosist ve birkaç te hücrelerinin kaldırılması zona pellucida sıralı açılış içerir (ortalama 7-8). Günde 3 lazer destekli hatching tabanlı blastosist biyopsi yöntemi6ile karşılaştırıldığında, bu prosedür blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gibi hassas prosedürlerin zamanında gerçekleştirilmesi gereken bir IVF biriminin günlük zamanlamasını kolaylaştırabilir. Blastokist tam genişlemesine ulaştığında biyopsi, kaldırmak için TE hücrelerini seçerek, böylece iç hücre kütlesinin (ICM) herniasyon riskini önleyerek, aksi takdirde prosedürü zorlu hale getiren bir şekilde yapılabilir. Literatürde, embriyo zaten blastosist aşamaya ulaştığında, prosedür5,7‘ den birkaç saat önce, lazer destekli hatching gerçekleştirilmesini içeren, Blastokist biyopsinin üçüncü bir protokolü de tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım daha zaman alıcı ve ağırlıklı olarak deneyimli operatörler ve orta-düşük günlük iş yükü görünümünde TE biyopsisi uygulayan ıVF ünitelerinde kullanılır.
Intrakyasmatik sperm enjeksiyonu (ıCSı)8 , IVF ‘de genetik analizler yapmaya nişan alırsanız konsolide bir teknik olmalıdır. Benzer şekilde, blastosist aşamaya güvenli bir şekilde embriyolar toplamak için uygun bir kültür sistemi, TE biyopsi stratejisinin uygulanması için çok önemlidir. Düşük oksijen geriliminin kullanımı, yeterli sayıda kulkısım, Blastokist oranını tehlikeye atmayın, bu amaçla anahtar önkoşullardır9. Aynı zamanda, bir PGT döngüsünü güvenli bir şekilde yönetmek için etkili bir ağoprezervasyon programı gereklidir. Son on yılda, vitrifikasyon uygulanması embriyo Cryo-hayatta kalma oranları bile > 99%10,11artırdı. Bu, genetik testler yapmak ve embriyo transferini aşağıdaki menstrüel döngüye ertelemek için yeterli zaman sağladı, uyarılamayan ve muhtemelen daha fazla reseptif endometrium12.
Her iki TE biyopsi ve vitrifikasyon sıkı becerileri gerektiren görevleri talep ve etkinliğini olmayan operatörler arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, her operatörün bu prosedürleri klinik olarak gerçekleştirmesine izin vermeden önce belirli bir eğitim süresi savunulmuş; Dahası, operatörün becerilerini bakım, ağoprezervasyon ve biyopsi prosedürleri için anahtar performans göstergelerini (KPI) izleyerek periyodik olarak değerlendirilmelidir. Her bir ıVF Kliniği, uluslararası konsorsiyum ve/veya referans laboratuvarları tarafından yayımlanan sonuçlar tarafından yayımlanan olanları yaklaşık olmalıdır bu amaçla iç KPI ‘Leri ayarlamanız gerekir.
TE biopsi, vitrifikasyon-ısınma ve tanık prosedürleri bizim ünitede, bu üç önceki yayınlarda bildirilen gibi tüm operatörler arasında standardize edilmiş teknikler doğrulandı11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Sadece iyi tecrübeli embriyologlar, eğitim süresini tamamlamış ve hem biyopsi hem de blastosist vitrifikasyonu gerçekleştirmelidir. Ayrıca, bir tanık, prosedürleri izlemek ve i sırasında etkili bir izlenebilirliği garanti etmek için gereklidir) biyopsi blastosist biyopsi çanak (Tamamlayıcı Şekil 1) sonrası biyopsi çanak (ek Şekil 1) hareketlerini ), ardından vitrifikasyon plakasına (Tamamlayıcı Şekil 1) ve son olarak vitrifikasyon desteğine (<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG ve RM verileri topladığımız ve taslağı tasarlanan. DC verileri analiz etti, temsili sonuçları hazırladı, istatistikleri gerçekleştirdi ve el yazması revize edildi. FMU ve LR, sonuçların ve tüm yazmanın eleştirel tartışmalarını sağladı.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
Referências
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
