면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부
Summary
여기서 우리는 IS의 형성 동안 B 림프구에서 세포 편광 사건을 특성화하는 두 가지 접근법을 기술한다. 첫 번째, 세포 기관 모집 및 시 냅 스 막에서 세포 골격 재배열의 정량화 포함. 두 번째는 면역 시냅스에 대한 편광을 겪는 중심도의 조성의 변화를 특성화하는 생화학적 접근법입니다.
Abstract
B 세포 수용체 (BCR)에 의한 표면 테더된 항원의 인식은 신호및 항원 세포 가 조정되는 면역 시냅스 (IS)의 형성을 유발합니다. IS 형성은 리소좀 및 골지 장치와 같은 중심도 및 관련 세포내 세포 기관의 시냅스 막에 편광된 모집을 수반하는 동적 액틴 리모델링을 포함한다. 액틴 리모델링의 초기 단계는 B 세포가 세포 표면을 증가시키고 시냅스에서 수집 된 항원 – BCR 복합체의 양을 최대화 할 수 있게합니다. 특정 조건하에서, B 세포가 단단한 표면에 관련되었던 항원을 인식할 때, 이 프로세스는 항원 추출을 촉진할 수 있는 리소좀의 현지 모집 및 분비에 결합됩니다. 취한 항원들은 T 도우미 세포에 대한 추가 프리젠 테이션을 위해 주요 조직 적합성 복합체 II (MHC-II) 분자에로드된 펩티드로 처리하기위한 전문 엔도 리소좀 구획으로 내재화됩니다. 따라서, IS의 형성과 관련되었던 세포역학을 공부하는 것은 B 세포가 활성화되는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 본 기사에서 우리는 B 세포에 있는 IS의 대형과 연관되는 세포 내 세포기관 위치 및 세포골격 재배열에 있는 변경을 공부하기 위하여 이용된 화상 진찰 그리고 생화확적인 기술 둘 다 토론할 것입니다.
Introduction
B 림프구는 다른 위협에 대하여 항체를 생성하고 병원체를 침입에 책임 있는 적응면역 계통의 필수적인 부분입니다. 항체 생산의 효율은 B 세포가 수용성 또는 표면 테더형형태로발생하는 항원을 획득, 공정 및 존재하는 능력에 의해 결정된다 1,2. BCR에 의해, 제시 세포의 표면에 부착된 항원의 인식은 IS3,4라고불리는 가까운 세포간 접촉의 형성을 이끈다. 이 동적 플랫폼 내에서 BCR 의존다운 스트림 신호 및 내분형 구획으로 항원의 내재화가 모두 일어난다. 업크업 된 항원 처리 및 MHC-II 분자에 조립 하 고 이후에 T 림프구에 제시. B-T 세포 협력이라고 불리는 생산적인 B-T 상호작용은 B 림프구가 항체 생산 혈장 세포 또는 기억 세포로의 분화를 촉진하는 적절한 신호를 수신할 수 있도록한다8.
2개의 기계장치는 B 세포에 의하여 항원 추출에서 관련시켰습니다. 첫 번째는 시냅스 갈라진 부분5,6에서모집과 융합을 겪는 리소좀에서 유래한 프로테아제의 분비에 의존합니다. 두 번째 는, 클라트린 코팅 구덩이 7로 내면화되는 막을 포함하는 항원의 질을 유발하는 Myosin IIA 매개 당기기힘에 달려 있습니다. 항원 추출 모드는 항원이 발견되는 멤브레인의 물리적 특성에 의존합니다. 그럼에도 불구하고, 두 경우 모두, B 세포는 두 가지 주요 리모델링 이벤트를 겪는다: actin 세포 골격 재구성 및 IS에 세포기관의 양극화. Actin 세포 골격 리모델링은 초기 확산 단계를 포함, 시 냅 스 막에서 actin 의존 돌출 항원과 접촉 하는 표면을 증가. 이것은 항원과 결합된 Bcrs가 분자 모터와 액틴 세포골격 리모델링 8,9,10의공동 작용에 의해 IS의 중심에 집중되는 수축 단계에 선행됩니다. 11. 세포기관의 편광은 또한 액틴 세포 골격의 리모델링에 의존합니다. 예를 들어, 중도체는 핵에서 결합되지 않고, 관련 액틴의 국소 탈중합에 의해, IS5,12에이 소기관의 위치를 재배치할 수 있게 한다. B 세포에서, 하나의 세포극(IS)에 중도의 위치(spositions)는 시냅스 막에 리소좀 모집을 안내하며, 이는 분비시 표면 테더된 항원의 추출 및/또는 처리를 용이하게 할 수 있다6. IS에서 모집된 리소좀은 MHC-II로 풍부하게 되며, 이는 T 세포13에제시될 내인성 구획에서 펩티드-MHC-II 복합체의 형성을 선호한다. 추가적으로, Golgi 장치는 또한 IS14에밀접하게 모집되는 것으로 관찰되었습니다, 분비 통로에서 골지 유래 소포가 항원 추출 및/또는 처리에 관여할 수 있었다는 것을 건의합니다.
전부, 시냅스 대형 도중 B 세포에 있는 세포내 세포기관 및 세포골격 재배열은 그들의 추가 활성화를 위해 요구된 능률적인 항원 취득 및 처리를 허용하는 중요한 단계입니다. 이 작품에서는 IS의 형성과 관련된 세포내 세포 내 리모델링을 연구하기 위해 B 세포에서 이미징 및 생화학 분석을 수행하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 소개합니다. 이러한 기술은 다음과 같습니다: (i) 항원 코팅 비드와 항원 코팅 커버슬립으로 활성화된 B 세포의 면역형광 및 이미지 분석, 이는 IS에 동원되는 세포내 성분의 시각화 및 정량화를 가능하게 한다(ii ) 자당 그라데이션에 대한 초원심분리에 의해 B 세포에서 중심도가 풍부한 분획을 분리하여 세포 극성 조절에 잠재적으로 관여하는 중도체와 관련된 단백질을 식별할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 B 림프구가 IS의 형성을 촉진하기 위해 세포 내 아키텍처를 재구성하는 방법을 연구하는 포괄적 인 방법을 설명합니다. 이 연구는 B 세포 활성화 도중 중심도, 골지 장치 및 리소좀과 같은 세포기관의 세포내 분포를 정량화하기 위하여 화상 진찰 기술의 사용을 포함하고, 어떻게 IS에 편광하는지. 추가적으로, 우리는 B 세포 활성화시 중심 조성물의 변화를 연구하는 생화확적인 접근을 기술?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y.는 FONDECYT #1180900 연구 보조금으로 지원됩니다. J.I., D.F. 및 J.L.은 코미시온 나시오날 드 시엔시아 y 테크놀로지아의 펠로우십에 의해 지원되었다. 우리는 비디오 녹화 및 편집에 대한 폰티피시아 유니버시다드 카토리카 드 칠레에서 데이비드 오소리오에게 감사드립니다.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
Referências
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