Estudio de la dinámica de los organelos en células B durante la formación de la sinapsis inmune
Summary
Aquí describimos dos enfoques para caracterizar los eventos de polarización celular en linfocitos B durante la formación de un IS. El primero, implica la cuantificación del reclutamiento de orgánulos y reordenamientos del citoesqueleto en la membrana sináptica. El segundo es un enfoque bioquímico, para caracterizar los cambios en la composición del centrosoma, que se somete a polarización a la sinapsis inmune.
Abstract
El reconocimiento de los antígenos de superficie por el receptor de células B (BCR) desencadena la formación de una sinapsis inmune (IS), donde se coordinan tanto la señalización como la admisión de antígenos. La formación de IS implica una remodelación dinámica de actina acompañada del reclutamiento polarizado a la membrana sináptica del centrosoma y los orgánulos intracelulares asociados, como los lisosomas y el aparato Golgi. Las etapas iniciales de la remodelación de actina permiten que las células B aumenten su superficie celular y maximicen la cantidad de complejos de antígeno-BCR reunidos en la sinapsis. Bajo ciertas condiciones, cuando las células B reconocen antígenos asociados a superficies rígidas, este proceso se acopla al reclutamiento local y la secreción de lisosomas, lo que puede facilitar la extracción de antígenos. Los antígenos recogidos se internalizan en compartimentos de endo-lisososoma sórdico especializados para su procesamiento en péptidos, que se cargan en moléculas principales del complejo de histocompatibilidad II (MHC-II) para su posterior presentación a las células auxiliares de T. Por lo tanto, el estudio de la dinámica de los órganos asociados con la formación de un IS es crucial para entender cómo se activan las células B. En el presente artículo discutiremos tanto la imagen como una técnica bioquímica utilizada para estudiar los cambios en el posicionamiento de los organosílamos intracelulares y los reordenamientos del citoesqueleto que están asociados con la formación de un IS en células B.
Introduction
Los linfocitos B son una parte esencial del sistema inmunitario adaptativo responsable de producir anticuerpos contra diferentes amenazas y patógenos invasores. La eficiencia de la producción de anticuerpos está determinada por la capacidad de las células B paraadquirir, procesar y presentar antígenos que se encuentran en una forma soluble o de superficie 1,2. El reconocimiento de antígenos unidos a la superficie de una célula presentadora, por elBCR, conduce a la formación de un contacto intercelular cercano llamado IS 3,4. Dentro de esta plataforma dinámica se lleva a cabo tanto la señalización aguas abajo dependiente sofocan bCR como la internalización de antígenos en compartimentos endo-lisososoma. Los antígenos recogidos se procesan y ensamblan en moléculas MHC-II y posteriormente se presentan a los linfocitos T. Las interacciones productivas B-T, llamadas cooperación con células B-T, permiten que los linfocitos Breciban las señales adecuadas, que promueven su diferenciación en células plasmáticas productoras de anticuerpos o células de memoria 8.
Dos mecanismos han participado en la extracción de antígenos por células B. El primero se basa en la secreción de proteasas procedentes de los lisomasque se someten a reclutamiento y fusión en la hendidura sináptica 5,6. El segundo, depende de las fuerzas de tracción mediadas por Myosin IIA que desencadena la invaginación de las membranas que contienen antígeno que se internalizan en fosas recubiertas de clathrin7. El modo de extracción de antígenos se basa en las propiedades físicas de la membrana en la que se encuentran los antígenos. Sin embargo, en ambos casos, las células B se someten a dos eventos de remodelación importantes: la reorganización del citoesqueleto de actina y la polarización de los orgánulos al EI. La remodelación del citoesqueleto de Actin implica una etapa inicial de propagación, donde las protuberancias dependientes de la actina en la membrana sináptica aumentan la superficie en contacto con el antígeno. Esto es seguido por una fase de contracción, donde los BCR junto con antígenos se concentran en el centro del Is por la acción concertada de los motores moleculares y la remodelación del citoesqueleto de actina8,9,10, 11. La polarización de los orgánulos también se basa en la remodelación del citoesqueleto de actina. Por ejemplo, el centrosoma se desacopla del núcleo, por despolimerización local de laactina asociada, lo que permite el reposicionamiento de este orgánulo al IS 5,12. En las células B, el reposicionamiento del centrosoma a un polo celular (IS) guía el reclutamiento de lisosoma a la membrana sináptica, que tras la secreción puede facilitar la extracción y/o procesamiento de antígenos de superficie6. Los lysosomes contratados en el IS se enriquecen con MHC-II, que favorece la formación de complejos péptido-MHC-II en compartimentos endosómicos que se presentarán a las células T13. Además, el aparato Golgi también se ha observado que está estrechamente reclutado para el IS14, lo que sugiere que las vesículas derivadas de Golgi de la vía secretora podrían estar involucradas en la extracción y / o procesamiento de antígenos.
En conjunto, los reordenamientos intracelulares del orgánulo y del citoesqueleto en las células B durante la formación de la sinapsis son los pasos clave que permiten la adquisición y el procesamiento eficientes del antígeno para su posterior activación. En este trabajo introducimos protocolos detallados sobre cómo realizar imágenes y análisis bioquímicos en células B para estudiar la remodelación intracelular de orgánulos asociados con la formación de un IS. Estas técnicas incluyen: (i) Inmunofluorescencia y análisis de imagen de células B activadas con cuentas recubiertas de antígeno y en cubiertas recubiertas de antígenos, lo que permite la visualización y cuantificación de componentes intracelulares que se movilizan al IS y (ii ) aislamiento de fracciones enriquecidas con centrosomas en células B por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa, lo que permite la identificación de proteínas asociadas con el centrosoma, potencialmente implicado en la regulación de la polaridad celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos un método integral para estudiar cómo los linfocitos B reorganizan su arquitectura intracelular para promover la formación de un IS. Este estudio incluye el uso de técnicas de imagen para cuantificar la distribución intracelular de orgánulos, como centrosoma, aparato Golgi y lisosomas durante la activación de la célula B, y cómo se polarizan al IS. Además, describimos un enfoque bioquímico para estudiar los cambios en la composición centrosomesoma sobre la activación de la célula B.
<p class…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. cuenta con el apoyo de una beca de investigación de la #1180900 FONDECYT. J.I., D.F. y J.L. contaron con el apoyo de becas de la Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Agradecemos a David Osorio de la Pontificia Universidad Católica de Chile por la grabación y edición de vídeo.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
Referências
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