Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias
Summary
Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.
Abstract
No passo de iniciação da tradução da proteína, o Ribossome liga-se à região de iniciação do mRNA. A iniciação da tradução pode ser obstruída pela ligação de uma proteína obrigatória do RNA (RBP) à região de iniciação do mRNA, que interfere com o emperramento ribossoma. No método apresentado, utilizamos este fenômeno de bloqueio para quantificar a afinidade vinculativa de RBPs aos seus locais de ligação cognato e não cognato. Para fazer isso, inserimos um site de vinculação de teste na região de iniciação de um mRNA de repórter e induzem a expressão do teste RBP. No caso da Associação RBP-RNA, observou-se uma repressão sigmoidal da expressão repórter em função da concentração de RBP. No caso de não afinidade ou de afinidade muito baixa entre o local de ligação e a RBP, não foi observada nenhuma repressão significativa. O método é realizado em células bacterianas ao vivo, e não requer maquinaria dispendiosa ou sofisticada. É útil para quantificar e comparar entre as afinidades de ligação de RBPs diferentes que são funcionais nas bactérias a um jogo de locais de ligação projetados. Este método pode ser inadequado para sites de ligação com alta complexidade estrutural. Isto é devido à possibilidade da repressão da iniciação ribosomal pela estrutura complexa do mRNA na ausência de RBP, que conduziria à expressão de gene mais baixa do repórter basal, e assim à repressão menos-Observable do repórter em cima da ligação de RBP.
Introduction
A regulação pós-transcricional de proteína de ligação de RNA (RBP), especificamente a caracterização da interação entre RBPs e RNA, tem sido extensivamente estudada nas últimas décadas. Existem vários exemplos de baixo-regulação translacional em bactérias originárias da inibição do rbps, ou diretamente competindo com, ligação Ribossome1,2,3. No campo da biologia sintética, as interações RBP-RNA estão surgindo como uma ferramenta significativa para o desenho de circuitos genéticos baseados em transcrição4,5. Portanto, há um aumento na demanda para caracterização dessas interações RBP-RNA em um contexto celular.
Os métodos mais comuns para o estudo das interações proteína-RNA são o ensaio eletroforético de deslocamento de mobilidade (EMSA)6, que é limitado a configurações in vitro, e vários ensaios pull-down7, incluindo o método de clipe8,9 . Quando tais métodos permiterem a descoberta de locais de ligação do RNA de de novo, sofrem dos inconvenientes tais como protocolos labor-intensivos e de reações de seqüenciamento profundas caras e podem exigir um anticorpo específico para a tração-para baixo de RBP. Devido à natureza suscetível do RNA ao seu ambiente, muitos fatores podem afetar as interações RBP-RNA, enfatizando a importância de interrogar a ligação RBP-RNA no contexto celular. Por exemplo, nós e outros temos demonstrado diferenças significativas entre as estruturas de RNA in vivo e in vitro10,11.
Baseado na aproximação de um estudo precedente12, Nós demonstramos recentemente10 que ao coloc locais obrigatórios pre-projetados para o capsídeo rbps dos bacteriófagos GA13, MS214, PP715, e qβ16 no região de iniciação de tradução de um repórter mRNA, a expressão do repórter é fortemente reprimido. Nós apresentamos um método relativamente simples e quantitativo, baseado neste fenômeno da repressão, para medir a afinidade entre RBPs e seu local de ligação RNA correspondentes in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito neste artigo facilita a medida in vivo quantitativa da afinidade obrigatória da RBP-RNA em pilhas de E. coli . O protocolo é relativamente fácil e pode ser conduzido sem o uso de maquinaria sofisticada, e a análise de dados é direta. Além disso, os resultados são produzidos imediatamente, sem o tempo de espera relativamente longo associado com os resultados de sequenciamento da próxima geração (NGS).
Uma limitação a este método é que trabalha somente e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto recebeu financiamento do programa I-CORE do Comitê de planejamento e orçamento e da Fundação de ciência de Israel (Grant no. 152/11), Marie Curie reintegration Grant no. PCIG11-GA-2012-321675, e do programa Horizonte 2020 de investigação e inovação da União Europeia, a Convenção de subvenção n. º 664918-MRG-gramática.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
Referências
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
- . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
- . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
- . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells – US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
- . NucleoSpin Plasmid – plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- . Protocol – How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
- . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
- . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
