伦蒂病毒介导基因在低附着板中制备的人类伪性沉默

功能β细胞质量的丧失是1型和2^{型糖尿病1}的中心病理学。虽然β细胞是胰腺胰岛胰岛素的产生者,但β细胞和非β细胞之间的通信在调节胰岛素分^泌2方面起着至关重要的作用。此外,胰高血糖素分泌不良导致糖尿病高血糖3。因此,对胰腺胰岛内细胞的基因表达进行调节,以解决糖尿病胰岛功能障碍发展背后的机制有着浓厚的兴趣。包括转基因小鼠在内的各种方法可用于调节小鼠胰岛的基因表达。然而,人类和小鼠胰岛表现出明显的内向、细胞分布、β与α细胞的比例以及对分泌^细胞4的响应。因此,直接评估人类胰岛的基因功能对于理解人类胰腺胰岛的病理生理学具有极其重要的作用。

腺病毒载体是体外转胰腺胰岛应用最广泛的病毒载体,因为非分裂细胞的转导效率很高。然而,腺病毒不能有效地渗透到胰岛的核心,特别是在人类胰岛5,并且在高剂量6细胞毒性。相比之下,慢病毒载体的细胞毒性较小,将外源基因永久地输送到后线细胞的染色体中,使其成为基因^治疗7的广泛测试载体。然而,扁豆病毒穿透完整人类胰岛核心的能力也有限,因此需要通过酶消化进行部分分散,以提高转导效率8。完整人类胰岛分散的注意事项是细胞-细胞和细胞基质通信的中断,这损害了胰岛素分泌的动态调节,这对维持人类葡萄糖平衡至关重要9。因此,在人类胰岛模型中评估基因调制对胰岛功能动态调节的影响一直具有挑战性。

众所周知,人类和啮齿类小岛的分散胰岛细胞可自主地重新聚合成称为”伪胰岛”的胰岛状结构。伪胰岛显示β和非β细胞分布类似于原生小岛10,11。此外,经过长期培养后,原生胰岛逐渐失去强大的第一期胰岛素分泌5,10,11,12。然而,与同一文化期5之后的本地小岛相比,伪胰岛在葡萄糖反应下,第一阶段胰岛素分泌的保存效果更好。除了更好地保存胰岛素分泌外,在低附着^板11中控制人体小岛细胞的重新聚集,为在将扁病毒载体重新聚集到其中提供了一个机会之窗伪小岛。几项研究已经证明了伪胰岛结合扁病毒介导转导的效用。Caton^等人13日报告说,与未感染对照相比,引入表达慢病毒的绿色荧光蛋白(GFP)对胰岛素分泌作用甚微,同时实现大鼠伪胰岛体内GFP的同质表达。他们还通过慢^病毒13过度表达康奈辛32、36和43,证明了不同康奈辛对胰岛素分泌的具体作用。用市售的96孔超低附着板制备的人类伪胰岛证明,经慢病毒介导的转录因子SIX3的过度表达可改善静态孵育^评估的胰岛素分泌。最近,用96孔超低附着板制备的人类伪胰岛通过慢病毒短发针RNA(shRNA)降低调节葡萄糖素酶,以证明其原理,表明葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少,同时KCl刺激胰岛素分泌保存5。研究还表明,人类伪胰岛在基因表达和分泌谱方面与原生胰岛相似,进一步支持了人类伪胰岛对胰岛功能5的调节的效用。虽然没有进行围产,但最近上市的生物工程微孔培养板也报告与慢病毒转导相容,并产生了具有优秀胰岛素的人类假小岛移植后体外和体内分泌11。总体而言,人类假岛的形成与慢病毒转导相结合是研究人类胰岛病理生理学的一种简单而有效的方法,为在人类胰岛中进行机械研究提供了宝贵的工具。

在本报告中,提出了一种利用两个市售平台——96孔超低附着板和微孔培养板——与慢病毒转导的人类伪小岛形成方案。两者都实现了基因表达的有效调制,并创造了与下游评估(包括静态孵育和围气又液)相容的人类伪岛。